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缺硒條件下誘導Nrf2靶基因
發表于：2021-09-01 作者：admin 來源：本站 點擊量：12688
原文：M Müller, Banning A , R Brigelius-Flohé, et al. Nrf2 target genes are induced under marginal selenium-deficiency[J]. Genes & Nutrition, 2010, 5(4):297-307.
翻譯：
關鍵詞：硒；Nrf2； II相酶； 腸；氧化應激
引言
在哺乳動物中，必需的微量元素硒作為硒代半胱氨酸并入硒蛋白活性中心發揮作用。人類有25個基因編碼硒蛋白[30]，其中許多涉及氧化還原過程[35]，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）[8]和硫氧還蛋白還原酶（TrxR）[14]。歐洲人口中存在的少量硒缺乏癥可能伴隨著輕微的氧化狀態[45]。 硒蛋白的表達取決于細胞中硒的狀態。但是，一些微陣列研究表明，硒的可用性也會影響非硒蛋白的表達（在[13]中進行了綜述）。仍然缺乏基本機制。硒狀態碼經常影響抗氧化劑防御酶和II期系統的酶[13,44]。一方面，大劑量的硒刺激諸如谷胱甘肽S轉移酶（GST）和NADPH：醌氧化還原酶（NQO1）等II期酶的活性。這種作用可以分別通過硒代半胱氨酸硒結合物[53]和二甲基二硒化物[58]來介導。另一方面，有強有力的證據證明在硒缺乏時會誘導抗氧化劑和II期酶的產生。早在1970年代末期，據報道血紅素加氧酶1（HMOX1）[12]以及GST活性在缺硒的大鼠肝臟中有所升高[32]。硒缺乏癥中抗氧化劑和II期酶的補償性上調的想法進一步得到了小鼠的發現，該小鼠具有針對器官的靶向去除編碼硒代半胱氨酸tRNA（Trsp）的基因。肝臟中硒蛋白的完全喪失導致了GSTPi，NQO1和HMOX1的誘導[52]。 參與細胞抗氧化劑防御和II期排毒的大多數蛋白質基因是由氧化還原和親電敏感的轉錄因子NF-E2相關因子（Nrf2）調控的（在[16]中進行了綜述），該因子與順式作用的抗氧化劑或親電反應元件（ARE / EpRE）[48，56]。 Nrf2-/-小鼠對化學誘導的毒性和腫瘤發生敏感[43]。另外，Nrf2-/-小鼠對氧化應激高度敏感[1]，并具有較低的基礎谷胱甘肽（GSH）水平[47]。在不受刺激的條件下，Nrf2保留在與Keap1結合的胞質溶膠中，Keap1充當基于Cul3的E3泛素連接酶的底物銜接子，并靶向Nrf2進行降解。靶基因的反式激活是響應活性氧（ROS）或親電試劑而引起的，這些試劑修飾Keap1的易感硫醇基團，導致核Nrf2蛋白水平迅速提高（在文獻[38]中進行了綜述）。 Trsp和Nrf2的同時破壞消除了II期酶的誘導，從而驗證了Nrf2在響應硒蛋白丟失中的作用[52]。與飼喂對照飲食的小鼠相比，飼喂缺硒飲食的ARE報告小鼠的ARE驅動的報告基因活性顯著增強[9]。另外，在缺硒的野生型小鼠中觀察到的GST和NQO1活性增加在Nrf2-/-小鼠中無法檢測到[9]。這提供了飲食中硒缺乏與Nrf2激活之間的第一個直接聯系。 基于這些結果，當前的研究集中在邊緣缺硒飲食對Nrf2調控基因表達的影響上。貧硒飲食中小鼠的建議每日允許攝入量（RDA）為一半[28]，反映出生理狀況可能會因改變營養習慣或季節性食物變化而同樣發??生。分析的目標器官是結腸和十二指腸的腸段，這是抵抗異種生物脅迫的第一道防線，還有肝臟，肝臟高度表達II期酶。先前研究[28]中獲得的微陣列數據的途徑分析未表明Nrf2途徑受到影響，因為所用程序GenMAPP不包含該途徑的MAPP（微陣列途徑概況）。因此，手動鑒定了48個Nrf2靶基因和12個經典II期酶，并通過qPCR證實了有趣的候選基因。
材料和方法
動物實驗
從先前報道的動物中獲取組織樣品[28]。對雄性C57BL / 6 J小鼠（3-4周齡）飼喂貧硒（0.086 mg Se / kg）或通過混合硒代蛋氨酸（Acros，比利時的蓋爾（Geel）陷入貧困的人（德國的拉格（Altromin））。喂養6周后，麻醉的動物因頸脫位而被處死。冷凍固定在液氮中的血漿和組織儲存在-80°C下。每組12只動物的硒狀態以血漿硒含量和肝GPx活性為特征，發現在中等硒缺乏時分別降低至硒充足的13％和35％[28]。
RNA分離
在液氮冷卻下將組織研磨。將20–30 mg的粉末懸浮在800μl的冷Trizol（Invitrogen，卡爾斯魯厄，德國）中，并用組織裂解器（Qiagen，Hilden，德國）以30 Hz勻化2×2分鐘。根據制造商的說明，使用Trizol方案分離RNA。用10 U RQ1 DNase（Promega，曼海姆，德國）消化基因組DNA，并通過苯酚-氯仿提取純化RNA。使用NanoDrop ND-1000（Peqlab Biotechnologie GmbH，德國埃爾蘭根）測量RNA濃度。
芯片分析
如前所述[28]，使用Mouse 44 K芯片（Agilent Technologies，Böblingen，德國）進行芯片分析。Student’s t-test檢驗可鑒定出顯著調控的基因（P <0.05）。 實時定量PCR 用150 fmol oligo（dT）15引物和180 U莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶（Promega）反轉錄RNA（3μg），總體積為45μl。
實時PCR
（Mx3005PTM QPCR系統，Stratagene，阿姆斯特丹，荷蘭）使用SYBR Green I（Molecular Probes，Eugene，USA）作為熒光報告物，在25μl反應混合物中以1μl十倍稀釋的cDNA一式三份進行。所有PCR反應的退火溫度分別為60和62°C（表1）。 PCR產物的定量范圍為1×103至1×109個拷貝的標準曲線。通過將至少一種引物置于PerlPrimer v1.1.14的外顯子/內含子邊界上，設計引物（表1，Sigma–Aldrich，Taufkirchen，德國）對cDNA具有特異性。參考基因Rpl13a和Hprt1的平均值用于在結腸和肝臟中qPCR結果的標準化，而Rpl13a僅用于十二指腸。
表1. 所用底物序列表
表2. 微陣列分析測量硒對結腸Nrf2靶基因作用
組織裂解液的制備
將10 mg磨碎的組織懸浮于含有2μl蛋白酶抑制劑混合物III（Calbiochem，Bad Soden，Germany）的250μl均質緩沖液（100 mM Tris-HCl，300 mM KCl，0.01％Triton X-100）中并用組織裂解器（Qiagen）在30 Hz下持續2×2分鐘。裂解液在21,000×g和4°C下離心15分鐘，然后根據Bradford [7]評估蛋白質含量。
蛋白質印跡
將等分試樣（20μg蛋白/泳道）進行SDS-PAGE，并按[5]所述進行印跡。用兔抗人NQO1抗血清（1：3,000； ab34173，Abcam，劍橋，英國）檢測到NQO1。通過兔抗人β-肌動蛋白抗血清（1：5,000； ab8229，Abcam）檢測到的β-肌動蛋白用作內部對照。使用過氧化物酶偶聯的抗兔抗體（1：50,000； Chemicon，霍夫海姆，德國）作為二抗。檢測是在以SuperSignal West Dura（德國波恩的Perbio）為底物的Fuji LAS3000-CCD系統中完成的。用Aida / 2D光密度測定法4.0軟件（Raytest，Straubenhardt，德國）對條帶進行定量。
NQO1活動
根據[42]測量雙香豆酚敏感的NQO1活性。在590 nm的微量滴定板吸光度讀取器上追蹤由甲萘醌介導的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）的還原（Synergy 2，Biotek Instruments GmbH，Bad Friedrichshall，德國），將不同的填充量校正為1厘米的路徑長度。將3μl裂解物與190μl反應緩沖液（25 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.665 mg / l BSA，0.01％Tween 20，5μMFAD，1 mM葡萄糖-6-磷酸鹽，30μM一起用于測定NADP，0.72 mM MTT，0.3 U / ml 6磷酸葡萄糖脫氫酶，50μM甲萘醌），總體積為250μl。 NQO1的活性計算為有和沒有雙香豆酚時MTT還原速率之間的差異，使用的還原MTT的消光系數在590 nm處估計為11,961（mol / l）-1×cm-1。
統計分析
比較兩組，通過未配對的Student’s t-test（GraphPadPrism®5.0版，美國加利福尼亞州圣地亞哥）計算出顯著差異。 P值<0.05被認為具有統計學意義。
結果
兩個Nrf2硒蛋白靶基因GPx2和TrxR1是特殊情況，因為它們的翻譯依賴于硒的可用性及其在層次結構中的排名。 高硒蛋白GPx2 [57]和TrxR1 [10]的mRNA在缺硒結腸中顯著降低，GPx2受影響小于TrxR1。 相反，兩種酶的mRNA在硒缺乏十二指腸中增強（圖3a，b）。 硒缺乏時GPx2 mRNA的上調已經在細胞培養中顯示[57]。 在限制硒條件下mRNA的穩定性使得在補充硒后能夠在缺硒細胞中快速重新合成GPx2 [57]。 兩種觀察都可以作為硒蛋白質層次中GPx2高級別的證據。NQO1 RNA在缺硒十二指腸中的上調與NQO1蛋白表達和活性相關
在蛋白質和活性水平上進一步分析NQO1作為Nrf2靶基因的原型。 在十二指腸中，NQO1蛋白和活性在缺硒組中顯著增強（圖4），與增強的mRNA相關（圖2a）。 在結腸中，蛋白質水平和活性都沒有改變，表明NQO1 mRNA的輕微增加不會通過增加的翻譯和活性反映出來。
討論
本研究是動物實驗的一部分，其中給小鼠喂食符合RDA的小鼠或硒含量降低至約50％的飲食[28]。雖然硒攝入量僅適度減少，但四種硒蛋白SelW，GPx1，SelH和SelM的RNA表達明顯下調，Wnt途徑的基因在結腸中上調[28]。對微陣列數據的人工分析表明，Nrf2靶基因和II期酶也受硒狀態的調節;在結腸中表達的60個基因中，41個被上調占68％（表2）。通過qPCR證實了12種用于抗氧化防御和II期酶的所選基因的表達（圖1和2）。 Nrf2靶基因在邊緣硒缺乏中的一致上調是高度相關的，因為次優的硒供應也可能是由人類經常消耗的低硒飲食造成的[45]。邊緣硒缺乏的建立與大多數其他研究高硒補充劑或嚴重缺硒的研究相反。
圖1.硒缺乏（-Se）小鼠與相對于不缺硒（+Se）小鼠的結腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中抗氧化酶的mRNA表達分析。 a血紅素加氧酶1（Hmox1），b金屬硫蛋白2（Mt2），c peroxiredoxin 1 (Prdx1), d sulfifiredoxin（Srxn1），e超氧化物歧化酶1（Sod1），f c-谷氨酰半胱氨酸合成酶，催化亞基（Gclc）?；虮磉_通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進行標準化。 在結腸中參考Hprt1和Rpl13a進行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設置+Se為1,采用t-test分析方法進行分析
圖2.硒缺乏（-Se）小鼠與相對于不缺硒（+Se）小鼠的結腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中II相酶的mRNA表達。NADPH：醌氧化還原酶（Nqo1）， b谷胱甘肽S轉移酶a1 / a2（Gsta1 / a2），c谷胱甘肽S轉移酶m1（Gstm1），d谷胱甘肽S轉移酶p1（Gstp1），e磺基轉移酶1b1（Sult1b1），f UDP葡糖醛酸糖基轉移酶1a6 a / b （Ugt1a6a / b）?；虮磉_通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進行標準化。 在結腸中參考Hprt1和Rpl13a進行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設置+Se為1,采用t-test分析方法進行分析。
此外，Burk及其同事提供了飲食中硒缺乏和Nrf2激活之間的第一個直接聯系，比較了每公斤飼喂0.25毫克亞硒酸鈉的完全缺硒或補充飲食的小鼠[9]。 在硒缺乏條件下，ARE驅動的報告基因活性以及GST和NQO1活性在野生型小鼠的肝臟中強烈增加，但在Nrf2 - / - 小鼠中沒有變化。 目前的研究表明，邊緣硒缺乏可導致II期酶的上調，強調了生物體對硒體內平衡變化的敏感程度。
圖3 硒缺乏（-Se）小鼠與相對于不缺硒（+Se）小鼠的結腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中硒蛋白的mRNA表達。 a 硫氧還蛋白還原酶1（Txnrd1）， b谷胱甘肽過氧化物酶2（Gpx2），c硒蛋白W（Sepw1）。 基因表達通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進行標準化。 在結腸中參考Hprt1和Rpl13a進行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設置+Se為1,采用t-test分析方法進行分析
圖4. 小鼠十二指腸中的NQO1蛋白表達和活性測試。 蛋白質測量通過Western Blot（a）方法，光密度分析與歸一化采用b-actin（b）方法。 通過降低MTT方法（c）來測量絕對NQO1活性。 *** P＜ 0.001； 設置+Se為1,采用t-test分析方法進行分析，詳情請參閱“材料和方法”
由于Nrf2靶基因表達不受肝臟中邊緣硒缺乏的影響（表3），但在腸道中上調，可以得出結論，腸道對減少的硒供應更敏感。 在Nrf2 - / - 小鼠的肝臟中，大多數已知的Nrf2靶基因被下調，而主要用于解毒的酶在Keap1敲低小鼠中增加，其特征在于Nrf2激活增加[47]。 作者得出結論，Nrf2的肝臟激活對于解毒比對抗氧化防御更重要。 在目前的研究中，在十二指腸中觀察到用于抗氧化防御的酶的明顯上調。 由于減少的氧化還原狀態維持腸上皮細胞增殖并防止早熟細胞凋亡[3]，對抗氧化防御酶的更高需求可以解釋目前的發現。
然而，也有相反的發現：當喂食0.01毫克硒/千克膳食或1毫克/千克時，解毒基因被硒缺乏下調[44]。 因此，硒含量相差100倍，而在本研究中，因子僅為2.相互矛盾的結果（[13]中綜述）可以解釋為超營養飲食可以誘導II期酶更多 比硒缺乏有效。 以超營養飲食作為缺乏飲食的參考，凈效應是硒缺乏的下調。
表3 肝臟中Nrf2靶基因和II期酶的qPCR結果
低硒含量和高硒含量影響的潛在機制似乎不同。 高濃度的某些硒化合物或代謝物可通過改變Keap1中的關鍵硫醇直接激活Nrf2途徑。 反應性巰基也可以通過氧化來修飾[22,29]，這種情況在硒缺乏中占主導地位[52,55]。 需要澄清中度缺硒小鼠中較高的氧化狀態是否是誘導的Nrf2靶基因表達的原因。
通過敲除肝細胞中Sec特異性tRNA（Trsp）的基因完全喪失所有硒蛋白，增強了幾種II期酶的表達，表明至少一種硒蛋白通常抑制Nrf2通路的激活[50]。為了降低推定候選者的數量，Sengupta及其同事使用了第二只小鼠品系，其中Trsp突變的方式只有管家而非壓力相關的硒蛋白表達。這些小鼠沒有對II期酶的代償性上調作出反應，這表明管家硒蛋白必須阻止Nrf2的活化[50]。由于硫氧還蛋白還原酶家族屬于管家硒蛋白[10]，因此分析了肝臟特異性TrxR1敲除對Nrf2途徑的潛在激活。實際上，TrxR1敲除導致Nrf2的核積累和21個Nrf2靶基因的誘導[51]。 TrxR2，TrxR3或硫氧還蛋白的mRNA水平未受影響。因此，TrxR1似乎抵消Nrf2激活和/或用作Nrf2激活的關閉信號。然而，缺乏TrxR1的肝臟未顯示氧化應激的證據，使潛在的機制不清楚[51]。
硒還影響編碼非硒蛋白的多個基因的表達，這些基因可能參與邊緣硒缺乏時Nrf2通路的特異性激活。 在之前的研究[28]中，我們發現Wnt通路被激活，表現為b-連環蛋白，Dvl2，Lef1和c-Myc的表達增強以及Gsk3β的下調。 Gsk3β是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅參與糖原代謝和經典Wnt信號傳導，而且還顯示出使Nrf2通路失活[23,49]。 Fyn激酶被磷酸化，從而被Gsk3β激活。 反過來，Phospho-Fyn使Nrf2磷酸化，導致Nrf2的核輸出[23]。 Gsk3β的活性降低，這可能是在先前研究中硒限制條件下從Gsk3β的下調推斷出的，可能會降低活性Fyn的量，從而導致Nrf2的核積累。
邊緣硒缺乏中Nrf2通路的激活與結直腸癌的發展有關。在炎癥引發的結腸直腸癌發生模型中，與野生型小鼠相比，Nrf2 - / - 小鼠的發病率，多樣性和腫瘤大小增加[25]。一方面，GST，SULT和UGT家族等II期酶參與異生物質的結合和排泄。加上抗氧化酶如過氧化物酶，硫化毒素，Sod1，Hmox1和金屬硫蛋白等基因的上調，可以保護機體免受氧化損傷。另一方面，Nrf2激活也可能有助于增加藥物輸出，抗藥性和腫瘤細胞存活[16,31]。因此，不能容易地確定Nrf2靶基因在硒缺乏中對結腸直腸癌的上調的結果。硒缺乏癥中Wnt途徑的激活指向低硒狀態的癌癥促進功能，并且與硒缺乏中較高的癌癥發病率一致（在[46]中綜述）。 Nrf2途徑的激活是否是通過內源性防御系統的強化來補償硒蛋白的損失的嘗試，或者它是否已經有助于癌細胞的存活，這是進一步研究的挑戰。
翻譯：
缺硒條件下誘導Nrf2靶基因
摘要：在歐洲，硒攝入不足似乎是普遍存在的。因此，目前的研究主要集中在攝入不足的條件下基因表達的變化。之前，有研究采用微陣列分析方法，揭示了小鼠在充足硒營養或中度缺乏硒營養喂養條件下的結腸的幾種途徑的基因的變化。同時有研究發現，嚴重的硒缺乏會影響適應性反應的Nrf2調節的基因。由于先前的分析途徑是采用不關聯Nrf2靶基因的程序開展的，而通過qPCR手動選擇和確認各自的基因表達變化，更具意義。qPCR顯示在缺硒飲食條件下，誘導II相酶（Nqo1，Gsts，Sult1b1和Ugt1a6）和抗氧化酶（Hmox1，Mt2，Prdx1，Srxn1，Sod1和Gclc），這被認為是對硒蛋白損失的補償。在十二指腸中觀察到最強的效果，其中抗氧化酶的基因被優先上調。這些還包括硒蛋白TrxR1和GPx2的mRNA，它們能夠在硒重新攝入時立即翻譯表達。在先前的論文中，觀察到的中度硒缺乏癥中Gsk3β的下調，為Nrf2途徑的激活提供了可能的解釋，因為Gsk3β的抑制導致Nrf2的積累。關鍵詞：硒；Nrf2； II相酶； 腸；氧化應激
引言
在哺乳動物中，必需的微量元素硒作為硒代半胱氨酸并入硒蛋白活性中心發揮作用。人類有25個基因編碼硒蛋白[30]，其中許多涉及氧化還原過程[35]，包括谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）[8]和硫氧還蛋白還原酶（TrxR）[14]。歐洲人口中存在的少量硒缺乏癥可能伴隨著輕微的氧化狀態[45]。 硒蛋白的表達取決于細胞中硒的狀態。但是，一些微陣列研究表明，硒的可用性也會影響非硒蛋白的表達（在[13]中進行了綜述）。仍然缺乏基本機制。硒狀態碼經常影響抗氧化劑防御酶和II期系統的酶[13,44]。一方面，大劑量的硒刺激諸如谷胱甘肽S轉移酶（GST）和NADPH：醌氧化還原酶（NQO1）等II期酶的活性。這種作用可以分別通過硒代半胱氨酸硒結合物[53]和二甲基二硒化物[58]來介導。另一方面，有強有力的證據證明在硒缺乏時會誘導抗氧化劑和II期酶的產生。早在1970年代末期，據報道血紅素加氧酶1（HMOX1）[12]以及GST活性在缺硒的大鼠肝臟中有所升高[32]。硒缺乏癥中抗氧化劑和II期酶的補償性上調的想法進一步得到了小鼠的發現，該小鼠具有針對器官的靶向去除編碼硒代半胱氨酸tRNA（Trsp）的基因。肝臟中硒蛋白的完全喪失導致了GSTPi，NQO1和HMOX1的誘導[52]。 參與細胞抗氧化劑防御和II期排毒的大多數蛋白質基因是由氧化還原和親電敏感的轉錄因子NF-E2相關因子（Nrf2）調控的（在[16]中進行了綜述），該因子與順式作用的抗氧化劑或親電反應元件（ARE / EpRE）[48，56]。 Nrf2-/-小鼠對化學誘導的毒性和腫瘤發生敏感[43]。另外，Nrf2-/-小鼠對氧化應激高度敏感[1]，并具有較低的基礎谷胱甘肽（GSH）水平[47]。在不受刺激的條件下，Nrf2保留在與Keap1結合的胞質溶膠中，Keap1充當基于Cul3的E3泛素連接酶的底物銜接子，并靶向Nrf2進行降解。靶基因的反式激活是響應活性氧（ROS）或親電試劑而引起的，這些試劑修飾Keap1的易感硫醇基團，導致核Nrf2蛋白水平迅速提高（在文獻[38]中進行了綜述）。 Trsp和Nrf2的同時破壞消除了II期酶的誘導，從而驗證了Nrf2在響應硒蛋白丟失中的作用[52]。與飼喂對照飲食的小鼠相比，飼喂缺硒飲食的ARE報告小鼠的ARE驅動的報告基因活性顯著增強[9]。另外，在缺硒的野生型小鼠中觀察到的GST和NQO1活性增加在Nrf2-/-小鼠中無法檢測到[9]。這提供了飲食中硒缺乏與Nrf2激活之間的第一個直接聯系。 基于這些結果，當前的研究集中在邊緣缺硒飲食對Nrf2調控基因表達的影響上。貧硒飲食中小鼠的建議每日允許攝入量（RDA）為一半[28]，反映出生理狀況可能會因改變營養習慣或季節性食物變化而同樣發??生。分析的目標器官是結腸和十二指腸的腸段，這是抵抗異種生物脅迫的第一道防線，還有肝臟，肝臟高度表達II期酶。先前研究[28]中獲得的微陣列數據的途徑分析未表明Nrf2途徑受到影響，因為所用程序GenMAPP不包含該途徑的MAPP（微陣列途徑概況）。因此，手動鑒定了48個Nrf2靶基因和12個經典II期酶，并通過qPCR證實了有趣的候選基因。
材料和方法
動物實驗
從先前報道的動物中獲取組織樣品[28]。對雄性C57BL / 6 J小鼠（3-4周齡）飼喂貧硒（0.086 mg Se / kg）或通過混合硒代蛋氨酸（Acros，比利時的蓋爾（Geel）陷入貧困的人（德國的拉格（Altromin））。喂養6周后，麻醉的動物因頸脫位而被處死。冷凍固定在液氮中的血漿和組織儲存在-80°C下。每組12只動物的硒狀態以血漿硒含量和肝GPx活性為特征，發現在中等硒缺乏時分別降低至硒充足的13％和35％[28]。
RNA分離
在液氮冷卻下將組織研磨。將20–30 mg的粉末懸浮在800μl的冷Trizol（Invitrogen，卡爾斯魯厄，德國）中，并用組織裂解器（Qiagen，Hilden，德國）以30 Hz勻化2×2分鐘。根據制造商的說明，使用Trizol方案分離RNA。用10 U RQ1 DNase（Promega，曼海姆，德國）消化基因組DNA，并通過苯酚-氯仿提取純化RNA。使用NanoDrop ND-1000（Peqlab Biotechnologie GmbH，德國埃爾蘭根）測量RNA濃度。
芯片分析
如前所述[28]，使用Mouse 44 K芯片（Agilent Technologies，Böblingen，德國）進行芯片分析。Student’s t-test檢驗可鑒定出顯著調控的基因（P <0.05）。 實時定量PCR 用150 fmol oligo（dT）15引物和180 U莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶（Promega）反轉錄RNA（3μg），總體積為45μl。
實時PCR
（Mx3005PTM QPCR系統，Stratagene，阿姆斯特丹，荷蘭）使用SYBR Green I（Molecular Probes，Eugene，USA）作為熒光報告物，在25μl反應混合物中以1μl十倍稀釋的cDNA一式三份進行。所有PCR反應的退火溫度分別為60和62°C（表1）。 PCR產物的定量范圍為1×103至1×109個拷貝的標準曲線。通過將至少一種引物置于PerlPrimer v1.1.14的外顯子/內含子邊界上，設計引物（表1，Sigma–Aldrich，Taufkirchen，德國）對cDNA具有特異性。參考基因Rpl13a和Hprt1的平均值用于在結腸和肝臟中qPCR結果的標準化，而Rpl13a僅用于十二指腸。
表1. 所用底物序列表
表2. 微陣列分析測量硒對結腸Nrf2靶基因作用
組織裂解液的制備
將10 mg磨碎的組織懸浮于含有2μl蛋白酶抑制劑混合物III（Calbiochem，Bad Soden，Germany）的250μl均質緩沖液（100 mM Tris-HCl，300 mM KCl，0.01％Triton X-100）中并用組織裂解器（Qiagen）在30 Hz下持續2×2分鐘。裂解液在21,000×g和4°C下離心15分鐘，然后根據Bradford [7]評估蛋白質含量。
蛋白質印跡
將等分試樣（20μg蛋白/泳道）進行SDS-PAGE，并按[5]所述進行印跡。用兔抗人NQO1抗血清（1：3,000； ab34173，Abcam，劍橋，英國）檢測到NQO1。通過兔抗人β-肌動蛋白抗血清（1：5,000； ab8229，Abcam）檢測到的β-肌動蛋白用作內部對照。使用過氧化物酶偶聯的抗兔抗體（1：50,000； Chemicon，霍夫海姆，德國）作為二抗。檢測是在以SuperSignal West Dura（德國波恩的Perbio）為底物的Fuji LAS3000-CCD系統中完成的。用Aida / 2D光密度測定法4.0軟件（Raytest，Straubenhardt，德國）對條帶進行定量。
NQO1活動
根據[42]測量雙香豆酚敏感的NQO1活性。在590 nm的微量滴定板吸光度讀取器上追蹤由甲萘醌介導的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）的還原（Synergy 2，Biotek Instruments GmbH，Bad Friedrichshall，德國），將不同的填充量校正為1厘米的路徑長度。將3μl裂解物與190μl反應緩沖液（25 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.665 mg / l BSA，0.01％Tween 20，5μMFAD，1 mM葡萄糖-6-磷酸鹽，30μM一起用于測定NADP，0.72 mM MTT，0.3 U / ml 6磷酸葡萄糖脫氫酶，50μM甲萘醌），總體積為250μl。 NQO1的活性計算為有和沒有雙香豆酚時MTT還原速率之間的差異，使用的還原MTT的消光系數在590 nm處估計為11,961（mol / l）-1×cm-1。
統計分析
比較兩組，通過未配對的Student’s t-test（GraphPadPrism®5.0版，美國加利福尼亞州圣地亞哥）計算出顯著差異。 P值<0.05被認為具有統計學意義。
結果
兩個Nrf2硒蛋白靶基因GPx2和TrxR1是特殊情況，因為它們的翻譯依賴于硒的可用性及其在層次結構中的排名。 高硒蛋白GPx2 [57]和TrxR1 [10]的mRNA在缺硒結腸中顯著降低，GPx2受影響小于TrxR1。 相反，兩種酶的mRNA在硒缺乏十二指腸中增強（圖3a，b）。 硒缺乏時GPx2 mRNA的上調已經在細胞培養中顯示[57]。 在限制硒條件下mRNA的穩定性使得在補充硒后能夠在缺硒細胞中快速重新合成GPx2 [57]。 兩種觀察都可以作為硒蛋白質層次中GPx2高級別的證據。NQO1 RNA在缺硒十二指腸中的上調與NQO1蛋白表達和活性相關
在蛋白質和活性水平上進一步分析NQO1作為Nrf2靶基因的原型。 在十二指腸中，NQO1蛋白和活性在缺硒組中顯著增強（圖4），與增強的mRNA相關（圖2a）。 在結腸中，蛋白質水平和活性都沒有改變，表明NQO1 mRNA的輕微增加不會通過增加的翻譯和活性反映出來。
討論
本研究是動物實驗的一部分，其中給小鼠喂食符合RDA的小鼠或硒含量降低至約50％的飲食[28]。雖然硒攝入量僅適度減少，但四種硒蛋白SelW，GPx1，SelH和SelM的RNA表達明顯下調，Wnt途徑的基因在結腸中上調[28]。對微陣列數據的人工分析表明，Nrf2靶基因和II期酶也受硒狀態的調節;在結腸中表達的60個基因中，41個被上調占68％（表2）。通過qPCR證實了12種用于抗氧化防御和II期酶的所選基因的表達（圖1和2）。 Nrf2靶基因在邊緣硒缺乏中的一致上調是高度相關的，因為次優的硒供應也可能是由人類經常消耗的低硒飲食造成的[45]。邊緣硒缺乏的建立與大多數其他研究高硒補充劑或嚴重缺硒的研究相反。
圖1.硒缺乏（-Se）小鼠與相對于不缺硒（+Se）小鼠的結腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中抗氧化酶的mRNA表達分析。 a血紅素加氧酶1（Hmox1），b金屬硫蛋白2（Mt2），c peroxiredoxin 1 (Prdx1), d sulfifiredoxin（Srxn1），e超氧化物歧化酶1（Sod1），f c-谷氨酰半胱氨酸合成酶，催化亞基（Gclc）?；虮磉_通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進行標準化。 在結腸中參考Hprt1和Rpl13a進行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設置+Se為1,采用t-test分析方法進行分析
圖2.硒缺乏（-Se）小鼠與相對于不缺硒（+Se）小鼠的結腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中II相酶的mRNA表達。NADPH：醌氧化還原酶（Nqo1）， b谷胱甘肽S轉移酶a1 / a2（Gsta1 / a2），c谷胱甘肽S轉移酶m1（Gstm1），d谷胱甘肽S轉移酶p1（Gstp1），e磺基轉移酶1b1（Sult1b1），f UDP葡糖醛酸糖基轉移酶1a6 a / b （Ugt1a6a / b）?；虮磉_通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進行標準化。 在結腸中參考Hprt1和Rpl13a進行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設置+Se為1,采用t-test分析方法進行分析。
此外，Burk及其同事提供了飲食中硒缺乏和Nrf2激活之間的第一個直接聯系，比較了每公斤飼喂0.25毫克亞硒酸鈉的完全缺硒或補充飲食的小鼠[9]。 在硒缺乏條件下，ARE驅動的報告基因活性以及GST和NQO1活性在野生型小鼠的肝臟中強烈增加，但在Nrf2 - / - 小鼠中沒有變化。 目前的研究表明，邊緣硒缺乏可導致II期酶的上調，強調了生物體對硒體內平衡變化的敏感程度。
圖3 硒缺乏（-Se）小鼠與相對于不缺硒（+Se）小鼠的結腸（n = 9）和 十二指腸（n = 6）中硒蛋白的mRNA表達。 a 硫氧還蛋白還原酶1（Txnrd1）， b谷胱甘肽過氧化物酶2（Gpx2），c硒蛋白W（Sepw1）。 基因表達通過qPCR分析，并在十二指腸采用Rpl13a進行標準化。 在結腸中參考Hprt1和Rpl13a進行平均。 * P＜ 0.05； ** P＜ 0.01； 設置+Se為1,采用t-test分析方法進行分析
圖4. 小鼠十二指腸中的NQO1蛋白表達和活性測試。 蛋白質測量通過Western Blot（a）方法，光密度分析與歸一化采用b-actin（b）方法。 通過降低MTT方法（c）來測量絕對NQO1活性。 *** P＜ 0.001； 設置+Se為1,采用t-test分析方法進行分析，詳情請參閱“材料和方法”
由于Nrf2靶基因表達不受肝臟中邊緣硒缺乏的影響（表3），但在腸道中上調，可以得出結論，腸道對減少的硒供應更敏感。 在Nrf2 - / - 小鼠的肝臟中，大多數已知的Nrf2靶基因被下調，而主要用于解毒的酶在Keap1敲低小鼠中增加，其特征在于Nrf2激活增加[47]。 作者得出結論，Nrf2的肝臟激活對于解毒比對抗氧化防御更重要。 在目前的研究中，在十二指腸中觀察到用于抗氧化防御的酶的明顯上調。 由于減少的氧化還原狀態維持腸上皮細胞增殖并防止早熟細胞凋亡[3]，對抗氧化防御酶的更高需求可以解釋目前的發現。
然而，也有相反的發現：當喂食0.01毫克硒/千克膳食或1毫克/千克時，解毒基因被硒缺乏下調[44]。 因此，硒含量相差100倍，而在本研究中，因子僅為2.相互矛盾的結果（[13]中綜述）可以解釋為超營養飲食可以誘導II期酶更多 比硒缺乏有效。 以超營養飲食作為缺乏飲食的參考，凈效應是硒缺乏的下調。
表3 肝臟中Nrf2靶基因和II期酶的qPCR結果
低硒含量和高硒含量影響的潛在機制似乎不同。 高濃度的某些硒化合物或代謝物可通過改變Keap1中的關鍵硫醇直接激活Nrf2途徑。 反應性巰基也可以通過氧化來修飾[22,29]，這種情況在硒缺乏中占主導地位[52,55]。 需要澄清中度缺硒小鼠中較高的氧化狀態是否是誘導的Nrf2靶基因表達的原因。
通過敲除肝細胞中Sec特異性tRNA（Trsp）的基因完全喪失所有硒蛋白，增強了幾種II期酶的表達，表明至少一種硒蛋白通常抑制Nrf2通路的激活[50]。為了降低推定候選者的數量，Sengupta及其同事使用了第二只小鼠品系，其中Trsp突變的方式只有管家而非壓力相關的硒蛋白表達。這些小鼠沒有對II期酶的代償性上調作出反應，這表明管家硒蛋白必須阻止Nrf2的活化[50]。由于硫氧還蛋白還原酶家族屬于管家硒蛋白[10]，因此分析了肝臟特異性TrxR1敲除對Nrf2途徑的潛在激活。實際上，TrxR1敲除導致Nrf2的核積累和21個Nrf2靶基因的誘導[51]。 TrxR2，TrxR3或硫氧還蛋白的mRNA水平未受影響。因此，TrxR1似乎抵消Nrf2激活和/或用作Nrf2激活的關閉信號。然而，缺乏TrxR1的肝臟未顯示氧化應激的證據，使潛在的機制不清楚[51]。
硒還影響編碼非硒蛋白的多個基因的表達，這些基因可能參與邊緣硒缺乏時Nrf2通路的特異性激活。 在之前的研究[28]中，我們發現Wnt通路被激活，表現為b-連環蛋白，Dvl2，Lef1和c-Myc的表達增強以及Gsk3β的下調。 Gsk3β是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅參與糖原代謝和經典Wnt信號傳導，而且還顯示出使Nrf2通路失活[23,49]。 Fyn激酶被磷酸化，從而被Gsk3β激活。 反過來，Phospho-Fyn使Nrf2磷酸化，導致Nrf2的核輸出[23]。 Gsk3β的活性降低，這可能是在先前研究中硒限制條件下從Gsk3β的下調推斷出的，可能會降低活性Fyn的量，從而導致Nrf2的核積累。
邊緣硒缺乏中Nrf2通路的激活與結直腸癌的發展有關。在炎癥引發的結腸直腸癌發生模型中，與野生型小鼠相比，Nrf2 - / - 小鼠的發病率，多樣性和腫瘤大小增加[25]。一方面，GST，SULT和UGT家族等II期酶參與異生物質的結合和排泄。加上抗氧化酶如過氧化物酶，硫化毒素，Sod1，Hmox1和金屬硫蛋白等基因的上調，可以保護機體免受氧化損傷。另一方面，Nrf2激活也可能有助于增加藥物輸出，抗藥性和腫瘤細胞存活[16,31]。因此，不能容易地確定Nrf2靶基因在硒缺乏中對結腸直腸癌的上調的結果。硒缺乏癥中Wnt途徑的激活指向低硒狀態的癌癥促進功能，并且與硒缺乏中較高的癌癥發病率一致（在[46]中綜述）。 Nrf2途徑的激活是否是通過內源性防御系統的強化來補償硒蛋白的損失的嘗試，或者它是否已經有助于癌細胞的存活，這是進一步研究的挑戰。
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