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具有兩個氧化還原中心的含硒醌基三唑的合成、抗腫瘤活性及其機理研究
發表于：2021-05-13 作者：admin 來源：本站 點擊量：14319
原文：Cruz E , Silvers M A , Jardim G , et al. Synthesis and antitumor activity of selenium-containing quinone-based triazoles possessing two redox centres, and their mechanistic insights[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 122:1-16.
翻譯：
在對抗不同類型癌癥的過程中，發展多種治療方法至關重要。醌類化合物被認為是一種特殊結構，是最重要的抗癌藥物之一。盡管單靶點藥物成功地抑制或激活了特定靶點，能夠同時作用于多種生物靶點的藥物在新藥設計中更具吸引力。在這種情況下，喹諾酮類化合物是一類重要的多目標化合物。
天然萘醌類化合物，如從塔貝屬植物心材中分離得到的拉帕醇和β-拉帕醇（β-lap），是研究最多的潛在抗腫瘤活性的化合物之一。Docampo等人發現β-lap在體外和S-180腫瘤的小鼠中對肉瘤180腹水腫瘤細胞（S-180細胞）有顯著的活性。雖然β-lap對Yoshida肉瘤和Walker-256癌細胞的抗腫瘤作用已被研究，但其確切的作用機制直到最近才被發現。
β-拉帕醇特異性地破壞內含NADP（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）的癌細胞，而不考慮p53、caspase或細胞周期狀態。雖然在臨床試驗中，β-lap（即ARQ 501）被錯誤地宣傳為細胞周期檢查點激活劑，但細胞死亡的主要決定因素是通過NQO1的表達。該藥物不是已知多藥耐藥或藥物泵的底物，β-lap細胞死亡不受細胞周期位置、致癌因子或促或抗凋亡因子的影響。最后，藥物靶點（即，被）NQO1，一種二期致癌誘導酶‘生物活性化’，該酶也由電離輻射（IR）在一些癌細胞（但不是正常細胞）中誘導。
β-Lap作為一種化療藥物的使用由于其高疏水性而受到限制，這種疏水性導致患者高鐵血紅蛋白血癥。當與載體羥丙基-β-環糊精混合時，載體本身有助于溶血。Ohayon和他的同事們最近闡明了β-lap對二氫喹啉酶的抑制作用是不可逆的假設。這些結果表明，β-Lap的治療作用可能與泛素特異性肽酶2（USP2）氧化有關，這可能是通過NQO1無效循環代謝β-lap產生活性氧（ROS）的下游效應。NQO1是一個獨特的基因，當被刪除時，會導致對b-lap和其他NQO1生物活性藥物產生耐藥性，強烈表明被引入的大多數下游效應是NQO1衍生的ROS上調和細胞內Ca2+增加的結果， PARP1過度激活NAD+- Keresis引起NAD+/ATP的快速和顯著損失。
在過去的幾年里，我們的團隊一直致力于合成和評估拉帕酮對癌細胞株的作用。我們發現了一系列具有改性C-環的拉帕醇（方案1a），它們對癌癥譜系具有很強的活性。最近，我們發現了具有獨特亞基的生物活性化合物，激發了人們對制備醌基三唑類化合物的興趣。最近，Perumal等人用同樣的分子雜交策略制備了具有抗細菌活性的氨基-1,4-萘醌-三唑類化合物。對MDA-MB-435癌細胞而言，β-拉帕醇基1,2,3-三唑具有顯著的活性，其IC50值小于2μM。這些化合物通過一種明顯的凋亡細胞死亡機制促進細胞死亡，這種機制與顯著的活性氧生成有關。在1，4-萘醌中插入三唑部分的方法也很有效，因為這個單元被稱為有效的藥效基團。最近，1,4-萘醌基1,2,3-三唑類化合物（方案1a）在HL-60人早幼粒細胞白血病細胞中被報道具有1.4-1.9μM的高活性。
從另一個角度看，有機硒化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗神經變性和抗病毒的特性。一系列的硒蛋白參與了重要的生理過程。Jocob和同事展示了硒仿醌（方案1b）潛在的抗腫瘤活性，其能夠模仿人酶谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的酶活性。GPx靶向氧化還原敏感的硫醇蛋白，同時在臨界閾值產生活性氧。因此，這些藥物充當活性氧使用者和活性氧增強劑，影響下游目標。這一作用將補充β-lap的作用機制，因為該試劑引起的死亡依賴于由ROS（H2O2）刺激的PARP1的過度激活。
在繼續獲得新的有效抗腫瘤萘醌的項目中，根據我們小組最近報告的發現，我們發現了含有β-lap的有效查爾根（方案1b）。在這里，我們描述了15種新的含硒醌類化合物，我們的策略是插入這個藥效團，生成含1,2,3-三唑硒的拉帕酮（方案1c）。所選的萘醌對幾種癌細胞株具有識別活性的結構框架，用于制備新化合物。這些結構被設計成可能導致NQO1細胞死亡的多靶配體。
2、結構與討論
2.1 化學
第一類具有兩個氧化還原中心的化合物是從拉帕醇（1）中獲得的含硒二氫吡喃萘醌（方案2）。以1為原料，經酸催化環合制備了α-拉帕酮2，并以2為原料合成了含硒衍生物6和7?；衔?strong>6，由銅（I）催化化合物4與（疊氮甲基）（苯基）硅烷的點擊反應以中等產率（75%）制備。中間體4是由3-乙炔基苯胺和溴代衍生物3反應得到的。如前所述，在二氯甲烷中3與疊氮化鈉反應容易合成4-疊氮-a-拉帕酮（5）。5與苯基炔丙基硒化物的反應得到含硒的α-拉帕酮1,2,3-三唑7。最后，從我們報道的疊氮化物衍生物9中，得到紅色固體β-lap基1，2，3-三唑10?；衔?strong>3-10是外消旋的。然而，化合物9和10是單非對映體，相對立體化學是反式的。通過與先前報道的數據對比，證實了反式立體化學。
我們開始合成含硒二氫呋喃萘醌，這是第二類化合物，最初是通過合成nor-α-拉帕醇衍生物15和16（方案3）。由于芳胺取代的拉帕酮和疊氮醌的合成在本組中已得到充分的證實，因此如方案3所示制備了化合物13和14。采用點擊法，化合物13和14分別與含硒疊氮化物和炔烴反應，得到萘醌15和16，產率分別為70%和80%。
以nor-拉帕醇（17）為原料，采用Pinto和同事描述的方法合成溴中間體18（方案4）。報道了由18而來的不同抗腫瘤化合物的合成，如芳胺基和烷氧基取代的nor-β-拉帕醇，在1,2,3-三唑基存在下的拉帕醇和硫酮的雜化物?；谙惹懊枋龅木哂锌拱┗钚缘幕衔?，制備了帶有末端炔基的未公開發表的芳胺基取代的拉帕酮19。本文所述含硒1,2,3-三唑21從19形成，使我們能夠得到設計有兩個氧化還原中心的產品。使用上述相同的策略，化合物22從疊氮化物衍生物20中獲得，先前由我們小組報告（方案4）。
在這一點上，我們描述了從其亞同系物拉帕醇（1）和非拉帕醇（17）中獲得的拉帕酮的合成。最近，我們報道了一類新的萘醌類化合物的合成，該類化合物由C-烯丙基指甲花醌（23）合成，含有1，2，3-三唑基序。23的碘化反應得到了68%的產率和1:1的比例（方案5）的化合物24和27，它們很容易被柱色譜分離。在這些化合物的作用下，疊氮化鈉與二甲基甲酰胺反應合成了疊氮化物衍生物，化合物25和28。通過銅催化疊氮炔環加成反應制備了相應的硒衍生物化合物26和29（方案5）。
1，4-萘醌與含硒的1，2，3-三唑偶聯也是我們的研究課題。從化合物33-35和39中，使用先前討論的方法制備了相應的三唑衍生物，化合物36-38和40（方案6）。得到了合適的化合物35和38的晶體，并用晶體學方法對其結構進行了表征。
最近，我們報道了一種直接的方法來獲得對映體富集的α-拉帕酮衍生物。為了鑒定新的對映體富集的抗腫瘤化合物，利用指甲花醌（41）與手性方酰胺通過有機催化制備了硝基衍生物42和43（方案7）。用NiCl2.6H2O/NaBH4將醌的硝基還原為氨基，得到了氨基醌44和45。由于不穩定，這些化合物在合成后立即用于在重氮轉移反應后制備疊氮醌46和47。在最后一步中，我們采用經典的點擊法，在二氯甲烷和水的1:1混合物中，通過抗壞血酸鈉和硫酸銅（II）的催化作用，與苯基丙炔硒醚反應，制備了含1,2,3-三唑48和49的硫系化合物。
通過1H、13C NMR和2D NMR譜（COSY、HMBC和HSQC）測定了新化合物4、6、7、10、13、15、16、19、21、22、26、29、36、37、38、40、48和49的結構。還獲得了電噴霧電離質譜，以確認化合物的特性。
2.2 生物學研究
所有含硒醌基1,2,3-三唑類化合物（方案2-7）及其合成前體均采用MTT法對六種腫瘤細胞系進行體外評價：HL-60（人早幼粒細胞白血病細胞，NQO1-）、HCT-116（人結腸癌細胞，NQO1）、PC3（人前列腺細胞，NQO1+）、SF295（人膠質母細胞瘤細胞，NQO1+），MDA-MB-435（黑色素瘤細胞，NQO1+）和OVCAR-8（人卵巢癌細胞，NQO1+）。β-拉帕酮和阿霉素作為陽性對照（表1）。NQO1-正常細胞、人外周血單個核細胞（PBMC）和小鼠成纖維細胞永生化細胞系（V79和L929）評價化合物的選擇性。還使用相當特異的NQO1抑制劑雙香豆素對所選化合物的NQO1-依賴性的機制方面進行了研究。如前所述，根據其活性將化合物分類為高活性（IC50<2 μM）、中等活性（2 μM50<10 μM）或非活性（IC50>10 μM）。
結果表明，大多數化合物對所評價的所有癌細胞株都有很強的抗腫瘤活性，IC50值<2 μM?？偟膩碚f，鄰喹諾酮類化合物比對苯二酚更為活躍。然而，還發現了具有強抗腫瘤活性的α-拉帕酮衍生物。
萘并吡喃醌5-7、9和10具有高到中等的活性（IC50在0.92-5.46μM范圍內），非活性化合物4是這類化合物的例外。對于含硒醌6和10，插入第二氧化還原中心的策略是成功的，并且這些衍生物比其萘醌前體更為活躍。對于含硒醌6和10，插入第二氧化還原中心的策略是成功的，并且這些衍生物比其萘醌前體更為活躍。近年來，我們報道了幾種α-拉帕酮基1，2，3-三唑類化合物的合成及其抗腫瘤活性。值得注意的是，含硒的1，2，3-三唑7比不含硫鍵的化合物表現出更好的活性。
萘呋喃醌是第二類化合物。對萘醌15和16對所研究的所有癌細胞株都有活性。在過去的幾年中，我們描述了從lapachol（1）中獲得的非α-lapachone基1,2,3-三唑，其IC50值大于2μM。本文中用于在硒存在下制備化合物15和16的策略提高了基于nor-α-lapachone的1,2,3-三唑類化合物的活性，并且這些衍生物的IC50值在0.68-1.71μM（15）和1.59-2.95μM（16）。
Nor-β-lapachone及其衍生物是來自lapachol基團的最有效的化合物之一。最近，我們還展示了Nor-β-lapachone在人淋巴細胞、HL-60白血病和永生正常小鼠V79成纖維細胞中的細胞毒性和遺傳毒性，其范圍為2.5～5μM。該化合物未能誘導非腫瘤細胞DNA損傷，但在最高濃度下，它誘導DNA單鏈和雙鏈斷裂，增加染色體畸變的頻率。它的生物學效應與其消耗谷胱甘肽（GSH）的能力有關，它導致了一種親細胞的親氧化細胞狀態，從而促進了它的抗增殖特性。
在此背景下，我們描述了nor-β-lapachones的有效抗腫瘤活性。重要的是，C-環修飾的，帶有芳胺基的nor-β-lapachones是所描述的最活躍的lapachones。這些化合物在人髓系白血病細胞系中具有顯著的抗增殖作用，并通過ROS產生氧化性DNA損傷。它們也以某種方式損害DNA修復活性，同時引發細胞死亡，這可能是細胞凋亡?；衔?strong>21是根據先前使用這些生物活性拉帕酮的經驗設計的。該化合物包含先前報道的3-芳胺基-nor-β-拉帕酮衍生物的結構框架，但通過點擊化學反應插入了第二個氧化還原硫族中心。這種物質對所有被評估的癌細胞系都具有高度的活性，IC50值在0.07到0.38μM之間。此外，化合物21具有高選擇性指數（SI表示為正常細胞和不同的癌細胞株之間的細胞毒性比率）。例如，PBMC vs HL-60=19.8。相比之下，阿霉素，一種臨床上用于治療各種癌癥的標準藥物，其選擇性指數值為10.6。同樣，化合物22（IC50在1.06-2.56μM范圍內）比不含硫族原子的nor-β-lapachone基1,2,3-三唑更具活性。本文報道了成功制備具有兩個氧化還原中心的強抗腫瘤醌的兩個重要實例?；衔?strong>26，另一種從胼胝酰指甲花醌（23）中獲得的nor-lapachone衍生物，也表現出很強的抗腫瘤活性。這種藥物被認為是高度活躍的，其IC50值在0.07到0.29μM之間，表明其具有高度活躍的結構?；衔?strong>21和26具有類似的抗腫瘤活性，顯示了正萘氟烷醌部分和三唑硒基團的重要性，它們可能在相同兩個氧化還原中心結構中協同工作。
還評估了1,4-萘醌36-40，這些化合物被認為是中等活性的，但化合物40對所檢測的所有癌細胞都不起作用。最后評估的化合物是不對稱的a-拉帕酮48和49，這些物質是不活躍的。正如我們最近所描述的，不對稱的a-拉帕酮衍生物對所評估的幾種癌細胞系無效。在此，我們試圖通過在這些醌類化合物中插入硫的方法來提高它們的活性，但這一策略失敗了。表2總結了最活躍化合物的選擇性指數。
我們實驗室先前的研究表明，化合物50-53（圖1）可被視為具有對抗多種癌細胞的有效抗腫瘤活性的原型。為了加深我們對化合物50-53作用機理的認識，并將先前報道的結構與含硒的拉帕酮為基礎的1,2,3-三唑類化合物進行比較，我們用設定的2小時暴露研究其潛在的NQO1依賴性細胞毒性，有或沒有NQO1抑制劑二糖醇。與相關正常組織相比，這種暴露利用了大多數實體癌中NQO1水平的升高。在含硒醌類化合物中，我們選擇了化合物21和22，以通過NQO1依賴機制評估其特性。
NQO1依賴性評估。在所測試的藥物濃度范圍內，該化合物對人肺腺癌A549（肺泡基底上皮細胞系）有活性。這些細胞表達高水平的NQO1（3000+300個酶單位）。由于添加了雙香豆素（DIC，一種NQO1抑制劑），許多受試化合物的細胞死亡是NQO1特異性的。根據存活曲線（圖2），先前報道的芳胺取代的nor-β-lapachone預測了IC50如下，化合物：50=2.6μM，51=1.8μM，52=2.4μM和53=1.3μM?；衔?strong>53在狹窄的治療窗口內顯示出最顯著的殺傷力，從0.8μM的93%存活率上升到1.6μM的11%?？偟膩碚f，化合物50-53是NQO1特異性藥物，其IC50值與β-拉帕酮相似或更低?；衔?strong>21和22，含硒醌，其IC50值分別為0.64和1.2μM，是該系列中最活躍的，并且具有NQO1依賴性（表3）。他們展示了巨大的治療窗口，使用DIC治療作為對NQO1細胞反應的替代物，如對幾乎所有人類正常組織的治療。這些反應是NQO1依賴性的無效的氧化還原循環，這些藥物產生大量的活性氧，特別是H2O2，最終導致PARP1過度活化和程序性壞死。
磷脂酰絲氨酸的外化被認為是細胞凋亡過程中的一個重要標志。經處理后，所選化合物21和22誘導細胞表面表達磷脂酰絲氨酸的PC3細胞數量顯著增加（圖3）。另一方面，在21和22暴露前用NAC預處理的培養物或與雙香豆素聯合處理的培養物中未觀察到磷脂酰絲氨酸外化（圖3）。我們的數據表明，測試化合物的細胞毒性機制可能涉及醌還原酶NQO1的藥物生物還原，以及強調ROS對細胞毒性的貢獻，這表明受試化合物誘導的細胞凋亡與ROS產生相關。最后，證實了這些研究，我們觀察到化合物21短時間暴露（1h）導致細胞內ROS的產生。另一方面，在用NAC預暴露的培養物中，化合物21不能產生ROS，這可以通過NAC行使的抗氧化保護來解釋。
3、結論
通過將兩個氧化還原中心、一個喹諾酮類部分和硒原子連接起來的策略，我們制備并評價了新的和多種含硒的醌基1,2,3-三唑化合物對正常細胞系的抗癌活性。我們評估了這些藥物的總體殺傷力（表1）以及NQO1的具體作用?？偟膩碚f，我們的方法是有效的，并且我們鑒定了IC50值低于0.3 μM的化合物，這些化合物比β-拉帕酮或阿霉素（一種用于治療幾種癌癥的標準臨床藥物）更有效。我們還研究了另外兩種活性化合物21和22的功效，發現它們被NQO1特異性地生物活性化，比我們之前發表的nor-β-lapachone具有更高的效價。有趣的是，我們發現，這些藥物中含有谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）樣活性，所選擇的硒含有nor-β-拉帕酮基1，2，3-三唑，是最有效的，并且在這兩個靶標上起作用。Annexin V細胞計數分析也被用于可視化化合物21和22的活細胞、早細胞和晚期凋亡階段的細胞群。21和22的細胞毒性機制與ROS對細胞毒性的貢獻本質上相關，提示凋亡與ROS產生有關。在此基礎上，我們描述了不同種類的醌類、鄰喹啉類和對苯二酚類化合物的抗腫瘤活性。例如，化合物29（對苯二酚）在所評估的癌細胞系中具有0.62-2.42μM范圍內的IC50。以化合物10、21、22和26為例，鄰醌的IC50在0.07-2.52μM之間。最后，我們已經描述了有效的抗腫瘤萘醌化合物，這些化合物作為治療過度表達NQO1的癌癥的有希望的分子出現。
翻譯：
具有兩個氧化還原中心的含硒醌基三唑的合成、抗腫瘤活性及其機理研究
1、介紹在對抗不同類型癌癥的過程中，發展多種治療方法至關重要。醌類化合物被認為是一種特殊結構，是最重要的抗癌藥物之一。盡管單靶點藥物成功地抑制或激活了特定靶點，能夠同時作用于多種生物靶點的藥物在新藥設計中更具吸引力。在這種情況下，喹諾酮類化合物是一類重要的多目標化合物。
天然萘醌類化合物，如從塔貝屬植物心材中分離得到的拉帕醇和β-拉帕醇（β-lap），是研究最多的潛在抗腫瘤活性的化合物之一。Docampo等人發現β-lap在體外和S-180腫瘤的小鼠中對肉瘤180腹水腫瘤細胞（S-180細胞）有顯著的活性。雖然β-lap對Yoshida肉瘤和Walker-256癌細胞的抗腫瘤作用已被研究，但其確切的作用機制直到最近才被發現。
β-拉帕醇特異性地破壞內含NADP（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）的癌細胞，而不考慮p53、caspase或細胞周期狀態。雖然在臨床試驗中，β-lap（即ARQ 501）被錯誤地宣傳為細胞周期檢查點激活劑，但細胞死亡的主要決定因素是通過NQO1的表達。該藥物不是已知多藥耐藥或藥物泵的底物，β-lap細胞死亡不受細胞周期位置、致癌因子或促或抗凋亡因子的影響。最后，藥物靶點（即，被）NQO1，一種二期致癌誘導酶‘生物活性化’，該酶也由電離輻射（IR）在一些癌細胞（但不是正常細胞）中誘導。
β-Lap作為一種化療藥物的使用由于其高疏水性而受到限制，這種疏水性導致患者高鐵血紅蛋白血癥。當與載體羥丙基-β-環糊精混合時，載體本身有助于溶血。Ohayon和他的同事們最近闡明了β-lap對二氫喹啉酶的抑制作用是不可逆的假設。這些結果表明，β-Lap的治療作用可能與泛素特異性肽酶2（USP2）氧化有關，這可能是通過NQO1無效循環代謝β-lap產生活性氧（ROS）的下游效應。NQO1是一個獨特的基因，當被刪除時，會導致對b-lap和其他NQO1生物活性藥物產生耐藥性，強烈表明被引入的大多數下游效應是NQO1衍生的ROS上調和細胞內Ca2+增加的結果， PARP1過度激活NAD+- Keresis引起NAD+/ATP的快速和顯著損失。
在過去的幾年里，我們的團隊一直致力于合成和評估拉帕酮對癌細胞株的作用。我們發現了一系列具有改性C-環的拉帕醇（方案1a），它們對癌癥譜系具有很強的活性。最近，我們發現了具有獨特亞基的生物活性化合物，激發了人們對制備醌基三唑類化合物的興趣。最近，Perumal等人用同樣的分子雜交策略制備了具有抗細菌活性的氨基-1,4-萘醌-三唑類化合物。對MDA-MB-435癌細胞而言，β-拉帕醇基1,2,3-三唑具有顯著的活性，其IC50值小于2μM。這些化合物通過一種明顯的凋亡細胞死亡機制促進細胞死亡，這種機制與顯著的活性氧生成有關。在1，4-萘醌中插入三唑部分的方法也很有效，因為這個單元被稱為有效的藥效基團。最近，1,4-萘醌基1,2,3-三唑類化合物（方案1a）在HL-60人早幼粒細胞白血病細胞中被報道具有1.4-1.9μM的高活性。
從另一個角度看，有機硒化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗神經變性和抗病毒的特性。一系列的硒蛋白參與了重要的生理過程。Jocob和同事展示了硒仿醌（方案1b）潛在的抗腫瘤活性，其能夠模仿人酶谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的酶活性。GPx靶向氧化還原敏感的硫醇蛋白，同時在臨界閾值產生活性氧。因此，這些藥物充當活性氧使用者和活性氧增強劑，影響下游目標。這一作用將補充β-lap的作用機制，因為該試劑引起的死亡依賴于由ROS（H2O2）刺激的PARP1的過度激活。
在繼續獲得新的有效抗腫瘤萘醌的項目中，根據我們小組最近報告的發現，我們發現了含有β-lap的有效查爾根（方案1b）。在這里，我們描述了15種新的含硒醌類化合物，我們的策略是插入這個藥效團，生成含1,2,3-三唑硒的拉帕酮（方案1c）。所選的萘醌對幾種癌細胞株具有識別活性的結構框架，用于制備新化合物。這些結構被設計成可能導致NQO1細胞死亡的多靶配體。
2、結構與討論
2.1 化學
第一類具有兩個氧化還原中心的化合物是從拉帕醇（1）中獲得的含硒二氫吡喃萘醌（方案2）。以1為原料，經酸催化環合制備了α-拉帕酮2，并以2為原料合成了含硒衍生物6和7?；衔?strong>6，由銅（I）催化化合物4與（疊氮甲基）（苯基）硅烷的點擊反應以中等產率（75%）制備。中間體4是由3-乙炔基苯胺和溴代衍生物3反應得到的。如前所述，在二氯甲烷中3與疊氮化鈉反應容易合成4-疊氮-a-拉帕酮（5）。5與苯基炔丙基硒化物的反應得到含硒的α-拉帕酮1,2,3-三唑7。最后，從我們報道的疊氮化物衍生物9中，得到紅色固體β-lap基1，2，3-三唑10?；衔?strong>3-10是外消旋的。然而，化合物9和10是單非對映體，相對立體化學是反式的。通過與先前報道的數據對比，證實了反式立體化學。
我們開始合成含硒二氫呋喃萘醌，這是第二類化合物，最初是通過合成nor-α-拉帕醇衍生物15和16（方案3）。由于芳胺取代的拉帕酮和疊氮醌的合成在本組中已得到充分的證實，因此如方案3所示制備了化合物13和14。采用點擊法，化合物13和14分別與含硒疊氮化物和炔烴反應，得到萘醌15和16，產率分別為70%和80%。
以nor-拉帕醇（17）為原料，采用Pinto和同事描述的方法合成溴中間體18（方案4）。報道了由18而來的不同抗腫瘤化合物的合成，如芳胺基和烷氧基取代的nor-β-拉帕醇，在1,2,3-三唑基存在下的拉帕醇和硫酮的雜化物?；谙惹懊枋龅木哂锌拱┗钚缘幕衔?，制備了帶有末端炔基的未公開發表的芳胺基取代的拉帕酮19。本文所述含硒1,2,3-三唑21從19形成，使我們能夠得到設計有兩個氧化還原中心的產品。使用上述相同的策略，化合物22從疊氮化物衍生物20中獲得，先前由我們小組報告（方案4）。
在這一點上，我們描述了從其亞同系物拉帕醇（1）和非拉帕醇（17）中獲得的拉帕酮的合成。最近，我們報道了一類新的萘醌類化合物的合成，該類化合物由C-烯丙基指甲花醌（23）合成，含有1，2，3-三唑基序。23的碘化反應得到了68%的產率和1:1的比例（方案5）的化合物24和27，它們很容易被柱色譜分離。在這些化合物的作用下，疊氮化鈉與二甲基甲酰胺反應合成了疊氮化物衍生物，化合物25和28。通過銅催化疊氮炔環加成反應制備了相應的硒衍生物化合物26和29（方案5）。
1，4-萘醌與含硒的1，2，3-三唑偶聯也是我們的研究課題。從化合物33-35和39中，使用先前討論的方法制備了相應的三唑衍生物，化合物36-38和40（方案6）。得到了合適的化合物35和38的晶體，并用晶體學方法對其結構進行了表征。
最近，我們報道了一種直接的方法來獲得對映體富集的α-拉帕酮衍生物。為了鑒定新的對映體富集的抗腫瘤化合物，利用指甲花醌（41）與手性方酰胺通過有機催化制備了硝基衍生物42和43（方案7）。用NiCl2.6H2O/NaBH4將醌的硝基還原為氨基，得到了氨基醌44和45。由于不穩定，這些化合物在合成后立即用于在重氮轉移反應后制備疊氮醌46和47。在最后一步中，我們采用經典的點擊法，在二氯甲烷和水的1:1混合物中，通過抗壞血酸鈉和硫酸銅（II）的催化作用，與苯基丙炔硒醚反應，制備了含1,2,3-三唑48和49的硫系化合物。
通過1H、13C NMR和2D NMR譜（COSY、HMBC和HSQC）測定了新化合物4、6、7、10、13、15、16、19、21、22、26、29、36、37、38、40、48和49的結構。還獲得了電噴霧電離質譜，以確認化合物的特性。
2.2 生物學研究
所有含硒醌基1,2,3-三唑類化合物（方案2-7）及其合成前體均采用MTT法對六種腫瘤細胞系進行體外評價：HL-60（人早幼粒細胞白血病細胞，NQO1-）、HCT-116（人結腸癌細胞，NQO1）、PC3（人前列腺細胞，NQO1+）、SF295（人膠質母細胞瘤細胞，NQO1+），MDA-MB-435（黑色素瘤細胞，NQO1+）和OVCAR-8（人卵巢癌細胞，NQO1+）。β-拉帕酮和阿霉素作為陽性對照（表1）。NQO1-正常細胞、人外周血單個核細胞（PBMC）和小鼠成纖維細胞永生化細胞系（V79和L929）評價化合物的選擇性。還使用相當特異的NQO1抑制劑雙香豆素對所選化合物的NQO1-依賴性的機制方面進行了研究。如前所述，根據其活性將化合物分類為高活性（IC50<2 μM）、中等活性（2 μM
結果表明，大多數化合物對所評價的所有癌細胞株都有很強的抗腫瘤活性，IC50值<2 μM?？偟膩碚f，鄰喹諾酮類化合物比對苯二酚更為活躍。然而，還發現了具有強抗腫瘤活性的α-拉帕酮衍生物。
萘并吡喃醌5-7、9和10具有高到中等的活性（IC50在0.92-5.46μM范圍內），非活性化合物4是這類化合物的例外。對于含硒醌6和10，插入第二氧化還原中心的策略是成功的，并且這些衍生物比其萘醌前體更為活躍。對于含硒醌6和10，插入第二氧化還原中心的策略是成功的，并且這些衍生物比其萘醌前體更為活躍。近年來，我們報道了幾種α-拉帕酮基1，2，3-三唑類化合物的合成及其抗腫瘤活性。值得注意的是，含硒的1，2，3-三唑7比不含硫鍵的化合物表現出更好的活性。
萘呋喃醌是第二類化合物。對萘醌15和16對所研究的所有癌細胞株都有活性。在過去的幾年中，我們描述了從lapachol（1）中獲得的非α-lapachone基1,2,3-三唑，其IC50值大于2μM。本文中用于在硒存在下制備化合物15和16的策略提高了基于nor-α-lapachone的1,2,3-三唑類化合物的活性，并且這些衍生物的IC50值在0.68-1.71μM（15）和1.59-2.95μM（16）。
Nor-β-lapachone及其衍生物是來自lapachol基團的最有效的化合物之一。最近，我們還展示了Nor-β-lapachone在人淋巴細胞、HL-60白血病和永生正常小鼠V79成纖維細胞中的細胞毒性和遺傳毒性，其范圍為2.5～5μM。該化合物未能誘導非腫瘤細胞DNA損傷，但在最高濃度下，它誘導DNA單鏈和雙鏈斷裂，增加染色體畸變的頻率。它的生物學效應與其消耗谷胱甘肽（GSH）的能力有關，它導致了一種親細胞的親氧化細胞狀態，從而促進了它的抗增殖特性。
在此背景下，我們描述了nor-β-lapachones的有效抗腫瘤活性。重要的是，C-環修飾的，帶有芳胺基的nor-β-lapachones是所描述的最活躍的lapachones。這些化合物在人髓系白血病細胞系中具有顯著的抗增殖作用，并通過ROS產生氧化性DNA損傷。它們也以某種方式損害DNA修復活性，同時引發細胞死亡，這可能是細胞凋亡?；衔?strong>21是根據先前使用這些生物活性拉帕酮的經驗設計的。該化合物包含先前報道的3-芳胺基-nor-β-拉帕酮衍生物的結構框架，但通過點擊化學反應插入了第二個氧化還原硫族中心。這種物質對所有被評估的癌細胞系都具有高度的活性，IC50值在0.07到0.38μM之間。此外，化合物21具有高選擇性指數（SI表示為正常細胞和不同的癌細胞株之間的細胞毒性比率）。例如，PBMC vs HL-60=19.8。相比之下，阿霉素，一種臨床上用于治療各種癌癥的標準藥物，其選擇性指數值為10.6。同樣，化合物22（IC50在1.06-2.56μM范圍內）比不含硫族原子的nor-β-lapachone基1,2,3-三唑更具活性。本文報道了成功制備具有兩個氧化還原中心的強抗腫瘤醌的兩個重要實例?；衔?strong>26，另一種從胼胝酰指甲花醌（23）中獲得的nor-lapachone衍生物，也表現出很強的抗腫瘤活性。這種藥物被認為是高度活躍的，其IC50值在0.07到0.29μM之間，表明其具有高度活躍的結構?；衔?strong>21和26具有類似的抗腫瘤活性，顯示了正萘氟烷醌部分和三唑硒基團的重要性，它們可能在相同兩個氧化還原中心結構中協同工作。
還評估了1,4-萘醌36-40，這些化合物被認為是中等活性的，但化合物40對所檢測的所有癌細胞都不起作用。最后評估的化合物是不對稱的a-拉帕酮48和49，這些物質是不活躍的。正如我們最近所描述的，不對稱的a-拉帕酮衍生物對所評估的幾種癌細胞系無效。在此，我們試圖通過在這些醌類化合物中插入硫的方法來提高它們的活性，但這一策略失敗了。表2總結了最活躍化合物的選擇性指數。
我們實驗室先前的研究表明，化合物50-53（圖1）可被視為具有對抗多種癌細胞的有效抗腫瘤活性的原型。為了加深我們對化合物50-53作用機理的認識，并將先前報道的結構與含硒的拉帕酮為基礎的1,2,3-三唑類化合物進行比較，我們用設定的2小時暴露研究其潛在的NQO1依賴性細胞毒性，有或沒有NQO1抑制劑二糖醇。與相關正常組織相比，這種暴露利用了大多數實體癌中NQO1水平的升高。在含硒醌類化合物中，我們選擇了化合物21和22，以通過NQO1依賴機制評估其特性。
NQO1依賴性評估。在所測試的藥物濃度范圍內，該化合物對人肺腺癌A549（肺泡基底上皮細胞系）有活性。這些細胞表達高水平的NQO1（3000+300個酶單位）。由于添加了雙香豆素（DIC，一種NQO1抑制劑），許多受試化合物的細胞死亡是NQO1特異性的。根據存活曲線（圖2），先前報道的芳胺取代的nor-β-lapachone預測了IC50如下，化合物：50=2.6μM，51=1.8μM，52=2.4μM和53=1.3μM?；衔?strong>53在狹窄的治療窗口內顯示出最顯著的殺傷力，從0.8μM的93%存活率上升到1.6μM的11%?？偟膩碚f，化合物50-53是NQO1特異性藥物，其IC50值與β-拉帕酮相似或更低?；衔?strong>21和22，含硒醌，其IC50值分別為0.64和1.2μM，是該系列中最活躍的，并且具有NQO1依賴性（表3）。他們展示了巨大的治療窗口，使用DIC治療作為對NQO1細胞反應的替代物，如對幾乎所有人類正常組織的治療。這些反應是NQO1依賴性的無效的氧化還原循環，這些藥物產生大量的活性氧，特別是H2O2，最終導致PARP1過度活化和程序性壞死。
磷脂酰絲氨酸的外化被認為是細胞凋亡過程中的一個重要標志。經處理后，所選化合物21和22誘導細胞表面表達磷脂酰絲氨酸的PC3細胞數量顯著增加（圖3）。另一方面，在21和22暴露前用NAC預處理的培養物或與雙香豆素聯合處理的培養物中未觀察到磷脂酰絲氨酸外化（圖3）。我們的數據表明，測試化合物的細胞毒性機制可能涉及醌還原酶NQO1的藥物生物還原，以及強調ROS對細胞毒性的貢獻，這表明受試化合物誘導的細胞凋亡與ROS產生相關。最后，證實了這些研究，我們觀察到化合物21短時間暴露（1h）導致細胞內ROS的產生。另一方面，在用NAC預暴露的培養物中，化合物21不能產生ROS，這可以通過NAC行使的抗氧化保護來解釋。
3、結論
通過將兩個氧化還原中心、一個喹諾酮類部分和硒原子連接起來的策略，我們制備并評價了新的和多種含硒的醌基1,2,3-三唑化合物對正常細胞系的抗癌活性。我們評估了這些藥物的總體殺傷力（表1）以及NQO1的具體作用?？偟膩碚f，我們的方法是有效的，并且我們鑒定了IC50值低于0.3 μM的化合物，這些化合物比β-拉帕酮或阿霉素（一種用于治療幾種癌癥的標準臨床藥物）更有效。我們還研究了另外兩種活性化合物21和22的功效，發現它們被NQO1特異性地生物活性化，比我們之前發表的nor-β-lapachone具有更高的效價。有趣的是，我們發現，這些藥物中含有谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）樣活性，所選擇的硒含有nor-β-拉帕酮基1，2，3-三唑，是最有效的，并且在這兩個靶標上起作用。Annexin V細胞計數分析也被用于可視化化合物21和22的活細胞、早細胞和晚期凋亡階段的細胞群。21和22的細胞毒性機制與ROS對細胞毒性的貢獻本質上相關，提示凋亡與ROS產生有關。在此基礎上，我們描述了不同種類的醌類、鄰喹啉類和對苯二酚類化合物的抗腫瘤活性。例如，化合物29（對苯二酚）在所評估的癌細胞系中具有0.62-2.42μM范圍內的IC50。以化合物10、21、22和26為例，鄰醌的IC50在0.07-2.52μM之間。最后，我們已經描述了有效的抗腫瘤萘醌化合物，這些化合物作為治療過度表達NQO1的癌癥的有希望的分子出現。
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