摘要
背景：人體必需微量元素硒，是具有廣泛健康作用的硒蛋白的組成成分。硒蛋白在血漿硒含量為125微克時會達到飽和，在該含量，硒蛋白P會達到平衡。而對于高于該含量是有益還是有害的，現在仍不清楚。
 
目的：在相對低硒水平的人群中，我們旨在研究長期補充不同劑量水平的硒對死亡率的影響。
 
設計：丹麥PRECISE研究是在4個實驗組間進行的一項單中心隨機雙盲安慰劑對照多組別的平行臨床研究。參與者是在丹麥歐登塞大學醫院招募的年齡在60-74歲之間的491名男性和女性志愿者。實驗最初設計了一個6個月的試點實驗，但是供給資金允許延長實驗并進行死亡率評估。受試者在1998-1999年間被隨機分配使用100、200或300微克/天的硒（富硒酵母）或安慰劑酵母5年，并對之后10年的死亡數進行隨訪（一直到2015年3月31日）。
 
結果：在隨訪的6871生存人年數中，死亡數為158例。在一項意向-治療分析中，300微克硒/天與安慰劑對照組的全因死亡率風險比（95%的置信區間）在治療5年后為1.62（0.66,3.96），整個隨訪期間為1.59（1.02,2.46）。100和200微克硒/天的劑量在治療停止后的實驗期內均未顯著降低死亡率。雖然我們缺乏除全因死亡率以外的其它參數，但硒對癌癥和心血管死亡率的影響似乎是相似的。
 
總結：在適度低硒水平的國家中，持續5年每天300微克劑量的硒攝入增加了10年后的全因死亡率。雖然我們的實驗最初并未包括死亡率評估的設計，樣本數量也有限，但實驗結論卻指出，超過300微克/天的總硒攝入和高劑量的補硒應該被避免。
 

摘要圖示

關鍵詞：硒；血漿硒含量；硒攝入；硒劑量；硒毒性；死亡率；癌癥死亡率；心血管死亡率；隨機對照實驗，丹麥PRECISE。
 
引言
硒是人類健康必需的一種微量元素。如構成人類25種硒蛋白的硒代半胱氨酸，這些硒蛋白具有廣泛的健康作用，尤其在減少氧化壓力和炎癥方面（1,2）。多種硒蛋白的單核苷酸多態性與年齡相關的疾病有關，如心血管疾?。–VD）和廣譜癌癥（1）。當血漿硒濃度達到125微克/升時，硒蛋白P（或許所有硒蛋白）的濃度將會達到一個平衡（3）。但補硒是否會導致高血漿硒濃度，尤其在持續補充時，是否會帶來什么有益的或確切有害的影響，這些都尚不清楚。
 
美國第三次全國健康和營養調查（NHANES）指出，血清硒和全因死亡率之間是一種U型的聯系，當血清硒為135微克/升時死亡率最低（4）。在另外六個觀察性研究（2,5-9）中，其中五個發現硒水平或硒攝入與死亡率之間呈逆相關，剩下一個顯示無影響（9）。這與U型劑量響應是一致的，這些實驗中的受試者均為血清硒含量或硒攝入量低或相對低的人群，而高含量血清硒對死亡率影響的相關信息仍是空白（4）。
 
僅有的兩項硒作為單一營養素的有死亡案例的隨機對照試驗均在美國進行。一項囊括了1312名受試者的癌癥營養預防實驗中，攝入200微克/天的硒（富硒酵母）讓平均血漿硒水平從114增加到了190微克/升，且非顯著性地減少了21%的全因死亡率和52%的癌癥死亡率（10），但是在之后6-8年的隨訪中并未發現對心血管疾病的死亡率有影響（11）。在一項囊括35533名男性受試者的硒與維生素E的癌癥預防實驗（SELECT）中，攝入200微克/天的硒（硒代蛋氨酸）讓受試者的平均血清硒水平從138增加到了252微克/升，且經過之后5.5和8年的隨訪并未發現其與全因或癌癥死亡率有關聯（12,13）。由于尚未有對相對低硒人群補硒并評估其對死亡率的長期影響的隨機試驗數據，所以我們旨在提供這些數據。我們將在這里報道丹麥（相對缺硒的國家）的一項長期補硒和死亡率的隨機雙盲對照試驗的結果。我們隨機挑選受試者攝入硒（100,200和300微克/天）或安慰劑5年，并在治療后隨訪10年。
 
 
實驗對象與方法
該項初步研究的方法已經在前面詳細敘述過，并總結如下。
 
實驗設計與樣本數
丹麥PRECISE初步研究（臨床試驗號：NCT01819649）是一項在丹麥歐登塞大學醫院進行的四個實驗組之間的單中心隨機雙盲安慰劑對照多組別平行實驗（分配比1:1:1:1）（14,15）。丹麥PRECISE實驗是提議的國際硒預防癌癥PRECISE實驗中的兩項初步研究之一，另一項在英國展開（16-18）。非形式冪計算被優先進行；樣本包含500名被仔細評估的受試者，并為一項大型實驗保留了足夠的隨訪時間。
 
結果變化
6個月后，相應的英國試驗終止，按計劃，擴大的資金使丹麥試點研究能夠持續進行5年，以期為擬議的國際PRECISE試驗提供資金。雖然這類資金從未得到保障，但為了確定死亡率，我們對丹麥實驗中受試者的隨訪仍持續了10年以上。需要指出的是，在啟動試驗時，死亡率評估并包括在計劃中。試驗議定書和隨后的修正案均可在網上獲得（19）。
 
參與者
從1998年11月到1999年6月，丹麥菲英郡的2897名年齡在60-74歲之間的男性和女性潛在參與者被邀請參與實驗。其中630名接受了邀請并被歐登塞大學醫院篩選。排除標準為：西南腫瘤組表現-狀態得分＞1，表明總體幸福感和日常生活能力受損；活動性肝腎疾??；患過癌癥（除非黑色素瘤皮膚癌以外）；HIV感染；正在接受免疫治療；不能理解說寫信息；在前6個月接受了≥50微克/天的硒補充。
 
隨機化
隨機化由計算機產生、鎖定，且未分層（14）。生活在一起的參與者夫婦被分配到相同的干預組。參加者、研究人員和調查人員對實驗分配均不知情（14）。
 
倫理委員會批準

瓦埃勒和芬南郡的區域數據保護機構和科學倫理委員會批準了數據收集前的研究（nr. 19980186）。
 
干預步驟
審核合適的參與者提供了血液樣本并被給予了酵母片作為4周開放標記的安慰劑實驗階段。符合納入標準的患者（n＝491）在安慰劑實驗階段中顯示出良好的依從性，并在給予了書面知情同意后，將其隨機分為0（安慰劑酵母）和100、 200或300微克硒/天的富硒酵母組（丹麥瓦埃勒SelenoPrecise© Pharma Nord）（圖1）。在基線、6, 12, 18個月、2, 3年和5年的時間點，于歐登塞大學醫院對參與者進行如前所述的評估（14）。干預5年后，對參與者進行10年的隨訪以確定死亡率。
 

 
基線參數
人口統計學特征、吸煙狀況、身高、體重和藥物使用等被收集作為基線水平。藥物使用從醫療記錄中獲得。發病率數據從丹麥國家病人登記處獲得，自1977年以來，該處記錄了所有住院病人出院的主要和次要診斷記錄，以及1995年以來所有的急診和門診記錄（20）。Charlson共病指數在隨機化之前通過增加的19個共病條件診斷來計算（21）。
 
硒測定
如先前詳細所述（14），在基線，6個月和5年時，總硒量經由英國Teddington肝素鋰等離子體LGC有限公司的電感耦合等離子體質譜法被測定。對標準品的分析表明該方法具有良好的準確性。樣品內的變異系數（CVS）分布從高硒濃度的樣品的0.5%到低硒濃度的樣品的3%。測定間變異系數為3.4%。
 
結果：死亡率確定
從1998—1999的隨機化之后直至2015年3月31日期間，受試者一直被隨訪以確定死亡率。死亡重要狀態和死亡日期經由丹麥民事登記系統獲得，該處記錄了自1968以來丹麥居民的所有死亡（22）。潛在死亡因素信息是綜合2010年12月31日以來的丹麥死亡原因登記冊（23）和2011年1月1日以來參加者的醫用圖表獲得的。死亡原因根據國際疾病分類（第十修訂版）歸因為癌癥（代碼C00 -C97）、心血管疾?。–VD）（I00～I99）和其他原因。2015年3月31日，在丹麥民事登記系統中，所有未發現死亡的人均確認存活并居住在丹麥。

意向-治療死亡率分析的檢驗效能計算
 
雖然在初始實驗設計之前并未正式測定樣本數量，但我們對現在的意向-治療死亡率分析進行了ad-hoc檢驗效能計算。在隨訪期間，平均樣本數為123的隨機治療組被觀察到其特定死亡風險高于安慰劑組（圖2），未調整的雙側顯著性水平為0.05，干預5年后，效能檢測出了50%和100%的潛在風險增加，治療組與對照組的全因死亡率分別為13.9%和35.7%，癌癥死亡率分別為8.7%和17.6%，心血管死亡率分別為8.1%和15.5%。 完成為期16年的隨訪后，效能檢測使全因死亡率的相同潛在風險分別增加至62.7%和99.5%，癌癥死亡率分別增加至29.7%和76.3%，心血管死亡率分別增加至21.0%和57.1%。因此，實驗可用效能可檢測出全隨訪期間50%的全因死亡率的風險增加和2倍癌癥和心血管死亡率的風險增加，但是不能檢測出最初干預五年的風險增加。
 

統計分析
不論依從性（意向-治療分析），所有的受試者均被隨機分配在治療組。累積死亡率通過Kaplan Meier法估算，并通過Wilcoxon非參數秩檢驗進行比對。用COX模型（比例風險回歸模型）比較了三組治療組與安慰劑組的死亡率風險比和95%的置信區間（CIs）。利用樣條擬合的參數化生存模型得到了平滑的累積死亡率統計曲線（24）。這些模型被用于在5、10和15年后隨訪中統計實驗組的死亡風險（95%置信區間），并隨著時間變化，計算三個治療組與對照組之間的累積風險差異和累積風險比。
我們評估了按年齡（＜65，≥65歲）、性別、吸煙狀態（當前未抽煙，抽煙）、體重系數（＜25，≥25千克/平方米）、Charlson共病指數（0,1-2）、藥物治療數（0,1-3）和血漿硒含量（＜80，≥80納克/克）分類的基線組治療效果的改變，以及Cox比例風險模型中治療組和相應協變量之間的主要項和相互作用。使用交互Wald檢驗相互作用系數來測試相互作用。顯著性水平設為0.05；所有報告中的P值均為雙側且不調整為多重檢驗，因為在主要分析中僅進行三次檢驗來同步比對四個治療組在整個隨訪期內的特定死亡率曲線，其中一項用于全因死亡率分析，另外兩項用于主要死因為癌癥和心血管疾病的死亡率分析。用14版的Stata（Stata 公司）進行數據統計，并用第3版的R語言進行制圖。
該研究由一個安全的監測委員會監督，所有組織的代表都參與了這項研究。
 
結果
491位隨機受試者的基線平均（SD）年齡和血漿硒含量分別為66.1（4.1）歲和86.5（16.3）納克/克（重量測量，納克/克可乘以1.027轉化為克/升）。只有49位受試者（10.0%）存在伴發病，56位（11.4%）受試者在使用超過一種藥物治療。血漿硒含量或其他基線水平上的受試者特征未發現有意義的不平衡（表1）。
 

 
在完成5年治療期前，共有108位參與者因非致命性不良事件、治療中的不良反應、無依從性、撤銷同意或未知/私人理由退出實驗（表1）。這些108名非致命性退出者，其中包括平均分布在各個實驗組的35名非致命性不良事件者（P=0.57）（14），因丹麥的死亡登記的完整性其信息已經被獲取用于死亡率分析。

補充5年后，100、200和300微克硒/天的治療組的平均（SD）血漿硒含量大幅度升高了，分別為158.3（28.3），222.2（40.6）和276.5（78.7）納克/克，但對照組的平均血漿硒含量并未改變，為87.7納克/克（24.2）（四個實驗組之間從基線到5年的變化齊性P＜0.001）（14）。

在幸存者中的平均（分布）隨訪年限為15.9（15.5-16.3）年。在隨訪的6871人年中，有158例死亡，其中31例發生在5年治療期間（癌癥18例，心血管疾病9例），127例發生在治療停止的10年后（癌癥57例，心血管疾病34例）（表1）。

實驗組之間的累積全因死亡率曲線出現顯著性差異（非參數曲線的同質性P=0.04）（圖2A）。隨機分類在300微克硒/天組的受試者們在治療5年后的死亡率表現出了平緩但非顯著性的增加（與對照組的風險比為1.62%，95%置信區間0.66,3.96），這種趨勢一直持續著，并在整個隨訪期間表現出了顯著性（風險比1.59,95%的置信區間1.02,2.46）（表2；附錄圖1A）。300微克硒/天組與安慰劑對照組的15年死亡率風險差異為11.3%（95%置信區間0.0,22.6%）（附錄圖2A）。100和200微克硒/天組在5年治療后的全因死亡率并未表現出顯著性減少，但在治療停止后補硒的影響逐漸消失了（表2，附錄圖1A）。對參與者基線特征的調節也并未實質性地改變結果。

 
補硒對癌癥死亡率（表2，圖2B，附錄圖2B）和對心血管疾病死亡率（表2，圖2C，附錄圖2C）的效果與全因死亡率相似，但是實驗組的特定死因死亡率之間存在非顯著性差異（癌癥和心血管疾病死亡率曲線齊性P=0.10和0.19）。300微克硒/天組與安慰劑對照組的癌癥死亡率風險比（95%置信區間）在5年治療后和全隨訪期間分別為2.17（0.65,7.21）和1.78（0.94,3.34），心血管疾病死亡率分別為2.17（0.40,11.85）和1.51（0.69,3.33）。

在基線亞群分析中，補充300微克/天的硒尤其增加了小于65歲男性和女性的死亡風險，但是在更年長的受試者中并未觀察到這一現象（治療-年齡相互作用P=0.04,圖3，附錄表1）。300微克硒/天組與安慰劑對照組在全隨訪期間的全因死亡率風險比（95%置信區間）在小于65歲的受試者中為3.12（1.51,6.44），大于等于65歲的受試者中為0.93（0.53,1.63）。在以性別、吸煙狀態、體重指數、Charlson共病指數、用藥數量、基線血漿硒水平分類的亞組中并未觀察到有統計顯著性的交互作用。

討論

治療5年并在適度低硒水平的國家生活10年后，300微克硒/天組（富硒酵母）與安慰劑對照組的全因死亡率風險比為11.3%（95%置信區間0.0,22.6%），表現出了顯著性的風險增加。癌癥與心血管疾病的死亡率也呈現出了類似的增加，但不具有統計學上的顯著意義。雖然100和200微克硒/天組的死亡率在5年治療期間表現出了非顯著性的減少，但在治療停止10年后這種影響消失了。
 
由于死亡率增加只在300微克硒/天組中被觀察到，所以不可能是硒蛋白的高含量或高活性導致了這種不良影響。當血漿硒濃度達到125微克/升時硒蛋白會趨向于飽和，在該濃度下硒蛋白P會達到平衡（3）；在治療6個月后，即使是最低劑量的硒補充也讓血漿硒濃度超過了該濃度達到了152納克/克（相當于156微克/升）。在我們的實驗中，尤其是200和300微克硒/天的實驗組會達到更高的血漿硒濃度，因此這可能主要是硒代蛋氨酸非特異性取代白蛋白中的蛋氨酸所致（3）。我們先前在一項小樣本PRECISE實驗的一項物種形成研究中測定了受試者們在治療6個月和5年后的血漿硒濃度（包括硒蛋白、高分子量硒和低分子量硒），并獲得了有趣的結果（Deitrich, Rayman, Moesgard, Goenaga-Infante,結果未發表）。當白蛋白中的硒含量從治療6個月到治療5年顯著增加時，兩個最高劑量水平下的硒蛋白含量卻顯著下降。這表明長期補充200或300微克/天劑量的硒會導致硒蛋白損耗，從而潛在性地減少其健康保護作用。在動物模型中過度補充營養膳食硒也會消耗硒蛋白（25,26），高劑量硒補充劑的有害影響中的一部分也許是因為硒蛋白活性的矛盾性減少。
 
在我們的實驗中硒酵母所含的主要的單一成分為硒代蛋氨酸（27）。通過分析蛋氨酸，硒代蛋氨酸能經由蛋氨酸途徑被代謝并經由轉硫途徑代謝為硒醇、硒高半胱氨酸和硒代半胱氨酸（28,29），然后能在蛋氨酸酶（一種存在于多種動物與人類組織中的酶）的作用下裂解為甲基硒醇（30）。硒醇與硫醇反應會生成能導致結構和功能有害改變的硒代硫化物/二硫化物，包括蛋白質聚合、轉錄因子失活和細胞氧化還原調節信號的中斷（31,32）。硒醇在生理PH下還會生成具有氧化還原循環能力并會產生超氧化物的硒化物（RSe-），從而引發氧化損傷（28,30）和潛在的癌癥和心血管疾病風險增加（33）。
 
對這種不良影響的另一個可能解釋是過量的硒會影響內質網中的蛋白質折疊。硒化物具有較高的氧化還原活性，可以影響蛋白質中的硫醇-二硫交換從而導致蛋白質的錯誤折疊或去折疊（31,34），從而引發內質網壓力并觸發未折疊蛋白響應（UPR，一種試圖恢復穩態的復雜信號網）（35）。的確，用5微摩爾（400微克/升）的硒（亞硒酸鹽）處理人工培育的內皮細胞后，血漿硒濃度達到了與300微克硒/天組相同量級的水平（284微克/升），其結果則是加強了數個內質網壓力標記mRNA的表達，減少了氮氧化物的產生，引起了超氧化物的生成并破壞了血管生成（36）。然而，因為硒處理種類的不同，這種對比間的相關性令人懷疑。由于ER壓力和UPR激活均與多種人類癌癥有關系，UPR激活還在近期被發現對癌癥發展至關重要（37），ER壓力感應和UPR激活也許能解釋在300微克硒/天組中的死亡率顯著增加。此外，硒化合物能引起DNA損傷或許是因為其能與硫醇反應從而破壞DNA修復蛋白功能的完整性，從而潛在性地增加患癌風險。
動力學研究表明，停止補充高劑量的硒代蛋氨酸后，其毒性作用隨著其在363天的全身周轉時間內的廣泛再生還可持續5年以上（39）。硒代蛋氨酸-硒引起的暴露時間的延長也許能解釋停止補充10年后的這種死亡率增加。補充亞硒酸鈉這樣的能立即用于硒蛋白合成或排泄（40）的補充物或許不會造成死亡率增加。
 
在我們的研究中，300微克硒/天組的死亡率增加集中在更年輕的受試者中。雖然這可能是多亞組分析中的一個偶然發現，但方法學和一些機械性的解釋或許能解答這個問題。方法學的解釋是，處于基線年齡的人群會被隨訪更長時間，我們能預想到該亞組的死亡率曲線會聚集在隨訪末端。因此在15年后HRs將提供潛在治療效果的向下偏估計；這種天花板效應會更多地出現在年長受試者群體中。機械性解釋是，在蛋氨酸/硒代蛋氨酸代謝中或許存在與年齡相關的差異（29,41）從而導致了這樣的結果，比如能代謝硒代蛋氨酸（41）或功能維生素B12從而影響一碳代謝的腸道菌群的改變，這在老年受試者中更有可能被發現。另一個可能則是，與隨著年齡增大帶來的眾所周知的肌肉流失相關（肌萎縮）。硒的全身周轉代謝率主要由包括骨骼?。ㄎ空伎偽?0%）在內的外周組織（39）所決定。當肌肉重量隨著年齡（44）而降低（45），更年長的受試者也許在其肌肉組織中會更少地積累硒代蛋氨酸，減少了其再利用的可能性，因而減少了硒暴露。又或者只是因為老年組有更強的競爭性風險因素。
 
我們研究的局限性在于：死亡率并非丹麥PRECISE實驗的主要目的，但是當資金足夠使干預持續五年時，為了謹慎解釋我們從posthoc分析中得到的結果，死亡率評估才被需要；實驗明顯是在健康的老年人中進行的，所以結果也許不能延伸到其它年齡組或患有不同伴生疾病的參與者中；108名存活的參與者（22.0%）在完成5年干預期前就退出了實驗，即使他們均衡地分布在各個組之間，并在意向-治療死亡率分析被統計；安慰劑對照組和300微克硒/天組的死亡數中僅有一些細微不同（前者為35，后者為47）。此外，在補充停止后隨訪的最后10年里也缺乏對硒水平的測定。重要的是，我們不能排除我們的研究中樣本數量過小、實驗最初設計并不包括評估死亡率等因素對我們實驗帶來的可能影響。但是這項在缺硒人群中的硒為單一因素的多劑量水平的長期隨機對照試驗完整地評估了死亡率（22,23），其結果對整個證據基礎作出了貢獻。
 
補硒效果依賴于劑量、硒種類和治療持續時間。我們的結果與在先前觀察實驗中的硒攝入和健康效應之間的U型劑量響應曲線是相符的（1）。在低硒攝入時，額外補硒也許能通過增加抗氧化硒蛋白的活性或含量來為機體提供保護作用。然而，當硒攝入已經足夠，額外補硒則可能如之前所述至少部分通過形成超氧化物而對機體產生毒性作用（29,31,32,36）?；蛟S125微克/升的血漿硒濃度足以滿足硒蛋白的需求（3），228微克/升的血漿硒濃度（我們實驗中通過補充200微克硒/天5年后達到的水平）并未出現不良影響反而為機體帶來了一些益處。在受試者具有更高硒攝入水平的SELECT實驗中（基線血清/血漿硒為139：91微克/升），200微克硒/天（硒代蛋氨酸）的劑量補充讓受試者的血清硒含量在補充4年后升為了252微克/升，且在5.5年后還存在可辨別出的硒的毒性癥狀，即RP（95%置信區間）、脫發1.28（1.01,1.62）和皮膚炎1.17（1.0,1.35），但是未發現死亡率增加（12,13）。在我們的研究中，300微克/天劑量的硒補充（硒酵母，含54%-60%硒代蛋氨酸）（14）在5年后使血漿硒水平升高至284微克/升，并顯著增加了10年后的死亡率。這些結果表明，應該避免連續5年總硒攝入量（飲食和含硒代蛋氨酸的補充劑）超過300微克/天。
 
我們的發現對那些能更輕易地攝入超過300微克硒/天的人群具有特別啟示。而根據基線水平和補充劑量，那些缺乏或少量缺硒的人群或許會通過補硒獲益（1）。雖然補充200微克硒/天也許對丹麥人或其他擁有相似基線硒水平的人群（如一些歐洲人）而言是安全的，但對于擁有更高基線硒水平的國家而言卻并不適用（如南美）。在對美國人群開展的NHANES2003-4代表性調查中（46），受試者的平均血清硒濃度達到了137微克/升，已經使硒蛋白達到了平衡。而在此基礎上繼續對美國成年人額外補充200微克硒/天也許會導致硒的毒性反應，如果持續補充5.5年以上還可能會導致更高的死亡風險。到2018年時，SELECT實驗中的男性受試者已經在治療后被隨訪了10年，對其死亡率的調查將會很有意思，就像丹麥PRECISE一樣。同時，盡管存在一些局限性，但我們的發現仍然建議公眾應該避免高劑量硒補充，尤其是在那些硒攝入充足的國家。
 
概要
(1)491名老年受試者被招募到硒補充劑的隨機對照試驗；(2)攝入300μg/d劑量的硒5 年增加了10年后的全因死亡率；(3)局限性：樣本量??；死亡率不是主要試驗終點；(4)應避免從食物和補充劑中攝入超過300μg/d的總硒。
 
 
原文：Rayman M P, Winther K H, Pastor-Barriuso R, et al. Effect of long-term selenium supplementation on mortality: results from a multiple-dose, randomised controlled trial[J]. Free Radical Biology & Medicine, 2018, 135.

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