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黑樹莓對人體結直腸癌遺傳和表觀遺傳學生物標志物的調控：I期先導研究
發表于：2019-02-19 作者：admin 來源：本站 點擊量：3563
目的：本研究考察了黑樹莓對人類結直腸腫瘤發展的生物標志物的影響，包括相關腫瘤抑制基因的甲基化、細胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt通路基因表達。
實驗設計：口服黑樹莓粉末（每天60g）前后，分別從20名患者毗鄰正常組織和結直腸腺瘤組織取樣檢查，持續9周。對5個腫瘤抑制基因啟動子區域的甲基化定量，測量DNA甲基轉移酶1（DNMT1）以及與細胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt信號傳導相關的基因的蛋白表達。
結果：三種Wnt抑制劑SFRP2、SFRP5、WIF1—— Wnt通路的上游基因，以及進展調節因子PAX6a的甲基化，在接受黑樹莓治療平均4周的病人的正常組織和結直腸腫瘤中得到了黑樹莓直接的保護調節作用；但該作用并沒有在接受黑樹莓治療1-9周的20個所有病人身上呈現。這與DNMT1的表達降低有關。BRBs以保護方式調節與Wnt通路、增殖、凋亡和血管發生相關的基因的表達。
結論：這些數據提供了BRBs具備使腫瘤抑制基因去甲基化和調節人結直腸腫瘤發展的其它生物標志物的能力的證據。盡管基因的去甲基化不不是在所有接受黑樹莓治療的患者的結腸直腸組織中都能發生，但是具有第二終點的陽性結果表明，對于BRBs預防人類結腸直腸癌的更多的研究是有必要的。
引言
結直腸癌是美國男性和女性中發生率排行第三的癌癥。估計在2009年將有49920人死于結直腸癌，大約占癌癥患者死亡數的9%。在過去二十年中，男性和女性結直腸癌的死亡率都有所下降，這反映了發病率下降和疾病早期篩查的增加。這種疾病的5年存活率為64％，并且在確診后10年繼續下降至57％。對于診斷時具有遠處轉移的患者，5年存活率僅為10％。因此，預防結腸直腸癌仍然是一個重要的目標，化學預防是實現這一目標的一種方法。
我們研究已經表明，在36周的試驗中，將含2.5％，5％和10％黑樹莓粉的合成飲食施用于氧化偶氮甲烷（AOM）處理的Fischer 344（F-344）大鼠導致相對于僅AOM組，腫瘤數量分別平均降低42％、45％、71%（P<0.05）。 我們還發現這些相同組中氧化性DNA加合物，8-羥基-20-脫氧鳥苷（8-OHdG）在尿液中水平顯著降低，表明漿果有減少氧化應激的能力。BRBs在大鼠結腸中減少AOM誘導的腫瘤的機制還沒有研究。然而，在使用亞硝胺誘導的食管鱗狀細胞癌（SCC）的大鼠模型的研究中，發現BRB能減少增殖、炎癥和血管生成，并刺激癌前細胞和組織的凋亡和分化，導致腫瘤發展減少。與這些細胞功能相關的基因也得到了BRBs的保護。
哺乳動物細胞中的DNA甲基化由一系列高度相關的DNA甲基轉移酶（DNMT1，DNMT3a和DNMT3b）調節，其介導甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移至二核苷酸序列CpG中胞嘧啶堿基的5號位。DNMT1在哺乳動物細胞中充當維持DNA甲基轉移酶，并且負責在細胞周期的S期間精確地復制基因組DNA甲基化模式。相反，DNA的從頭甲基化被認為由具有維持和從頭DNA甲基化活性的DNMT3a和DNMT3b酶進行。然而，兩組酶顯示在體外表現出一定水平的維持和從頭甲基化，這表明DNMT的這種分類可能被過度簡化。確認DNA甲基化在腫瘤發生中的重要性，研究顯示所有3種DNMT在幾種腫瘤類型中過度表達，包括結腸和直腸、膀胱和腎的腫瘤。當DNMT1和DNMT3b在結腸癌細胞中被敲除時，腫瘤抑制基因的甲基化或諸如p16基因幾乎完全消除，并且基因重新表達。因此，DNMT的抑制可導致沉默基因的去甲基化和再活化。DNMT的腫瘤抑制基因的異常甲基化可能是化學預防的有希望的目標。 DNMT抑制劑目前正在開發作為癌癥的潛在治療劑。
異常Wnt/β-連環蛋白（Wnt）通路發生在約85%的散發性結腸直腸癌中，并且主要歸因于Apc基因的突變。最近的研究結果表明Wnt通路在細胞增殖，分化和干細胞維持中的重要作用。由于失調的基因甲基化導致的Wnt信號傳導的破壞也是人結腸直腸癌中的常見事件，例如，Wnt負調節因子，分泌的卷曲相關蛋白2和5（SFRP2和SFRP5）、Wnt抑制因子1（WIF1）的頻繁甲基化。已在異常隱窩灶（ACF）和原發性結腸癌細胞中檢測到SFRP基因啟動子區的甲基化。SFRP在結腸癌細胞中的重新表達阻斷Wnt信號傳導并導致細胞凋亡。重要的是，這些事件發生在結腸癌細胞中表現出β-連接蛋白突變，它是Wnt通路中的下游基因。據報道在結腸癌細胞中p16、CDKN2A—— 一種細胞周期調節因子、PAX6a—— 一種發展調節因子的沉默，與啟動子高甲基化相關。與DNA堿基的突變變化不同，腫瘤抑制基因的DNA甲基化模式的潛在可逆性表明這些是預防和/或治療結腸直腸癌的可行靶標。
這項研究的目的是調查短期BRBs食療對Wnt抑制劑——SFRP2，SFRP5和WIF1，以及p16和PAX6a的影響，并在人類結腸直腸癌組織中調節DNMT家族酶。漿果對Wnt通路中下游基因的蛋白表達的影響，即β-連接蛋白、E-鈣粘蛋白、c-Myc、細胞增殖標志物（Ki-67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD-105）也都是考察對象。我們的研究結果表明，每天口服BRBs持續平均約4周，在人結直腸組織中會產生多表觀遺傳和細胞生物標志物保護調節。這些效應好像是結腸直腸組織局部吸收漿果中的活性物質而發生的。
材料和方法
臨床試驗
本實驗中評估BRBs對結腸直腸癌發展生物標志物的影響是由俄亥俄州立大學綜合癌癥中心的機構審查委員會和得克薩斯大學圣安東尼奧分校批準的。在參與試驗之前，從所有患者手中獲得書面知情同意書。該試驗中的大多數患者是被診斷患有結腸直腸癌的人，并且被送到奧約州立大學詹姆斯癌癥醫院進行手術。因此，為了符合該試驗的條件，他們必須同意進行第二次結腸鏡檢查或乙狀結腸鏡檢查（取決于腫瘤位置）以獲得基線結腸直腸腫瘤和相鄰的正常組織用于研究。
A：入選標準
試驗中的患者有以下情況之一：
i）具有早期結腸直腸癌（原發性或復發性）的病理診斷的患者，其在結腸或直腸中具有原發性損傷，并且被認為是選擇性結腸直腸手術的候選者。
ii）診斷為IV期結直腸癌而在肝或腹部具有轉移性損害（癌癥病變）的患者也是合格的，條件是原發性損傷存在于結腸或直腸中，并且計劃手術切除結直腸病變。
iii）由于大小或其他原因（例如接受抗凝治療），需要進行重復結腸鏡檢查或乙狀結腸鏡檢查或手術切除而無法通過初始結腸鏡或乙狀結腸鏡切除的具有結腸息肉或腺瘤的病理診斷的患者。
iv）外科醫生慎重判斷認為結直腸惡性腫瘤高可能性的患者，具有諸如貧血，直腸出血，體重減輕，腸運動習慣變化，結腸直腸腫塊的X射線證據等歷史記錄，這些患者符合要求。
v）如果沒有阻塞性病變或阻塞性癥狀，直腸癌患者在進行放化療或手術前是合格的。
B：排除標準
從試驗中排除的患者具有以下之一：
i）阻塞或出血的臨床癥狀，并考慮立即手術。
ii）直腸癌或阻塞性病變的候選患者，需立即新的輔助性化/放療治療或手術。
iii）目前正在接受化療或放射治療的患者（自最后一次化療治療后大于4周和放射治療后大于3周）。
iv）服用非甾體抗炎藥（NSAIDs）的患者，由于其臨床癥狀不能停藥。
v）懷孕或哺乳期患者。
vi）具有不受控的、未補償的心臟，肺或肝臟疾病，或不受控制的傳染病或糖尿病。
黑樹莓
從俄亥俄農場購買新鮮冷凍的BRBs（Jewel品種，2004年收獲），并冷凍運送到伊利諾斯州莫門斯的范德魯南農場，如所述進行冷凍干燥。BRBs的營養物分析和包裝詳見補充方法。
黑莓用量管理
一劑20g冷凍干燥的漿果粉末與約100mL水混合，每天口服3次（總共60g /d）持續1-9周。每天定期服用漿果粉3次，間隔6小時。60克漿果粉每天接近1.3磅新鮮BRB，相當于7％嚙齒動物樹莓粉飲食。發現BRB粉末在大鼠飲食中以2.5％至10％的濃度提供時，對大鼠結腸具有化學預防作用。
漿果處理前和漿液處理期間的評估
起初，給所有患者進行身體檢查，在此期間獲得他們的醫療/手術史，并且完成了乳酸脫氫酶（LDH），癌胚抗原（CEA），完全血細胞計數（CBC）和完全代謝組的實驗室測試。然后，他們參加了一次24小時的口頭食物召回，以便在用漿果粉治療之前建立富含酚類食物（包括漿果產品）的消費模式。在漿果治療期間，每周評估患者一次依從性和任何不良事件。在試驗期間，要求患者避免使用除黑莓粉之外的漿果類型。
組織和尿液收集
所有入選試驗的患者在進入試驗前都診斷為結腸直腸癌。 因為用于初始診斷的組織不可用于研究，所以有必要在漿果治療患者之前獲得另外的組織標本。最初，患者簽署了同意書，之后他們停止使用NSAIDs。大約5天后，從結直腸癌患者體內取三個活體樣本，每一個毗鄰于正常組織（距離腫瘤組織小于2nm的位置）和腫瘤組織。將每份活體樣本的一半置于10％福爾馬林緩沖液中，另一半在液氮中冷凍?；颊咴诓杉M織活檢后約24小時開始每天服用BRBs粉末，并直到手術去除腫瘤前12-36小時。在手術時，從每個患者體內取出毗鄰正常和腫瘤組織的另外3個活體樣本，并如預處理活檢所述那樣放置在緩沖的福爾馬林中或冷凍。所有組織標本由醫學病理學家W. Frankel博士在組織病理學上分類為正?；蚰[瘤組織。所有腫瘤均為腺瘤。
在基線水平和漿果處理后收集了治療前和治療后的尿液樣本（每個約50mL）。 為了確保漿果花色苷的穩定性，將樣本加入5％三氟乙酸降低PH至酸性后保存在-80℃。
測量結直腸組織和尿中的漿果花色苷
在補充方法中詳述了樣品制備和HPLC-MS / MS分析和花青素的定量。
DNA甲基化的分析
A. DNA提取和亞硫酸氫鹽轉化。相鄰的正常和腫瘤組織用于提取基因組DNA，如補充方法中所述。
B. 質量序列。高通量MassARRAY用于定量p16，PAX6a，SFRP2，SFRP5和WIF1的CpG島的甲基化水平，如補充方法中所詳述。
C. 焦磷酸測序。使用LINE-1重復元件亞硫酸氫鹽/焦磷酸測序來評估整體的甲基化水平，如補充方法中所詳述。
免疫組織化學染色和計算機輔助圖像分析
免疫組織化學染色程序和β-連環蛋白，E-鈣粘蛋白，c-Myc，Ki-67，TUNEL，p16，CD105或DNMT1的染色定量在補充方法中詳述。
統計分析
實驗設計：口服黑樹莓粉末（每天60g）前后，分別從20名患者毗鄰正常組織和結直腸腺瘤組織取樣檢查，持續9周。對5個腫瘤抑制基因啟動子區域的甲基化定量，測量DNA甲基轉移酶1（DNMT1）以及與細胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt信號傳導相關的基因的蛋白表達。
結果：三種Wnt抑制劑SFRP2、SFRP5、WIF1—— Wnt通路的上游基因，以及進展調節因子PAX6a的甲基化，在接受黑樹莓治療平均4周的病人的正常組織和結直腸腫瘤中得到了黑樹莓直接的保護調節作用；但該作用并沒有在接受黑樹莓治療1-9周的20個所有病人身上呈現。這與DNMT1的表達降低有關。BRBs以保護方式調節與Wnt通路、增殖、凋亡和血管發生相關的基因的表達。
結論：這些數據提供了BRBs具備使腫瘤抑制基因去甲基化和調節人結直腸腫瘤發展的其它生物標志物的能力的證據。盡管基因的去甲基化不不是在所有接受黑樹莓治療的患者的結腸直腸組織中都能發生，但是具有第二終點的陽性結果表明，對于BRBs預防人類結腸直腸癌的更多的研究是有必要的。
引言
結直腸癌是美國男性和女性中發生率排行第三的癌癥。估計在2009年將有49920人死于結直腸癌，大約占癌癥患者死亡數的9%。在過去二十年中，男性和女性結直腸癌的死亡率都有所下降，這反映了發病率下降和疾病早期篩查的增加。這種疾病的5年存活率為64％，并且在確診后10年繼續下降至57％。對于診斷時具有遠處轉移的患者，5年存活率僅為10％。因此，預防結腸直腸癌仍然是一個重要的目標，化學預防是實現這一目標的一種方法。
我們研究已經表明，在36周的試驗中，將含2.5％，5％和10％黑樹莓粉的合成飲食施用于氧化偶氮甲烷（AOM）處理的Fischer 344（F-344）大鼠導致相對于僅AOM組，腫瘤數量分別平均降低42％、45％、71%（P<0.05）。 我們還發現這些相同組中氧化性DNA加合物，8-羥基-20-脫氧鳥苷（8-OHdG）在尿液中水平顯著降低，表明漿果有減少氧化應激的能力。BRBs在大鼠結腸中減少AOM誘導的腫瘤的機制還沒有研究。然而，在使用亞硝胺誘導的食管鱗狀細胞癌（SCC）的大鼠模型的研究中，發現BRB能減少增殖、炎癥和血管生成，并刺激癌前細胞和組織的凋亡和分化，導致腫瘤發展減少。與這些細胞功能相關的基因也得到了BRBs的保護。
哺乳動物細胞中的DNA甲基化由一系列高度相關的DNA甲基轉移酶（DNMT1，DNMT3a和DNMT3b）調節，其介導甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移至二核苷酸序列CpG中胞嘧啶堿基的5號位。DNMT1在哺乳動物細胞中充當維持DNA甲基轉移酶，并且負責在細胞周期的S期間精確地復制基因組DNA甲基化模式。相反，DNA的從頭甲基化被認為由具有維持和從頭DNA甲基化活性的DNMT3a和DNMT3b酶進行。然而，兩組酶顯示在體外表現出一定水平的維持和從頭甲基化，這表明DNMT的這種分類可能被過度簡化。確認DNA甲基化在腫瘤發生中的重要性，研究顯示所有3種DNMT在幾種腫瘤類型中過度表達，包括結腸和直腸、膀胱和腎的腫瘤。當DNMT1和DNMT3b在結腸癌細胞中被敲除時，腫瘤抑制基因的甲基化或諸如p16基因幾乎完全消除，并且基因重新表達。因此，DNMT的抑制可導致沉默基因的去甲基化和再活化。DNMT的腫瘤抑制基因的異常甲基化可能是化學預防的有希望的目標。 DNMT抑制劑目前正在開發作為癌癥的潛在治療劑。
異常Wnt/β-連環蛋白（Wnt）通路發生在約85%的散發性結腸直腸癌中，并且主要歸因于Apc基因的突變。最近的研究結果表明Wnt通路在細胞增殖，分化和干細胞維持中的重要作用。由于失調的基因甲基化導致的Wnt信號傳導的破壞也是人結腸直腸癌中的常見事件，例如，Wnt負調節因子，分泌的卷曲相關蛋白2和5（SFRP2和SFRP5）、Wnt抑制因子1（WIF1）的頻繁甲基化。已在異常隱窩灶（ACF）和原發性結腸癌細胞中檢測到SFRP基因啟動子區的甲基化。SFRP在結腸癌細胞中的重新表達阻斷Wnt信號傳導并導致細胞凋亡。重要的是，這些事件發生在結腸癌細胞中表現出β-連接蛋白突變，它是Wnt通路中的下游基因。據報道在結腸癌細胞中p16、CDKN2A—— 一種細胞周期調節因子、PAX6a—— 一種發展調節因子的沉默，與啟動子高甲基化相關。與DNA堿基的突變變化不同，腫瘤抑制基因的DNA甲基化模式的潛在可逆性表明這些是預防和/或治療結腸直腸癌的可行靶標。
這項研究的目的是調查短期BRBs食療對Wnt抑制劑——SFRP2，SFRP5和WIF1，以及p16和PAX6a的影響，并在人類結腸直腸癌組織中調節DNMT家族酶。漿果對Wnt通路中下游基因的蛋白表達的影響，即β-連接蛋白、E-鈣粘蛋白、c-Myc、細胞增殖標志物（Ki-67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD-105）也都是考察對象。我們的研究結果表明，每天口服BRBs持續平均約4周，在人結直腸組織中會產生多表觀遺傳和細胞生物標志物保護調節。這些效應好像是結腸直腸組織局部吸收漿果中的活性物質而發生的。
材料和方法
臨床試驗
本實驗中評估BRBs對結腸直腸癌發展生物標志物的影響是由俄亥俄州立大學綜合癌癥中心的機構審查委員會和得克薩斯大學圣安東尼奧分校批準的。在參與試驗之前，從所有患者手中獲得書面知情同意書。該試驗中的大多數患者是被診斷患有結腸直腸癌的人，并且被送到奧約州立大學詹姆斯癌癥醫院進行手術。因此，為了符合該試驗的條件，他們必須同意進行第二次結腸鏡檢查或乙狀結腸鏡檢查（取決于腫瘤位置）以獲得基線結腸直腸腫瘤和相鄰的正常組織用于研究。
A：入選標準
試驗中的患者有以下情況之一：
i）具有早期結腸直腸癌（原發性或復發性）的病理診斷的患者，其在結腸或直腸中具有原發性損傷，并且被認為是選擇性結腸直腸手術的候選者。
ii）診斷為IV期結直腸癌而在肝或腹部具有轉移性損害（癌癥病變）的患者也是合格的，條件是原發性損傷存在于結腸或直腸中，并且計劃手術切除結直腸病變。
iii）由于大小或其他原因（例如接受抗凝治療），需要進行重復結腸鏡檢查或乙狀結腸鏡檢查或手術切除而無法通過初始結腸鏡或乙狀結腸鏡切除的具有結腸息肉或腺瘤的病理診斷的患者。
iv）外科醫生慎重判斷認為結直腸惡性腫瘤高可能性的患者，具有諸如貧血，直腸出血，體重減輕，腸運動習慣變化，結腸直腸腫塊的X射線證據等歷史記錄，這些患者符合要求。
v）如果沒有阻塞性病變或阻塞性癥狀，直腸癌患者在進行放化療或手術前是合格的。
B：排除標準
從試驗中排除的患者具有以下之一：
i）阻塞或出血的臨床癥狀，并考慮立即手術。
ii）直腸癌或阻塞性病變的候選患者，需立即新的輔助性化/放療治療或手術。
iii）目前正在接受化療或放射治療的患者（自最后一次化療治療后大于4周和放射治療后大于3周）。
iv）服用非甾體抗炎藥（NSAIDs）的患者，由于其臨床癥狀不能停藥。
v）懷孕或哺乳期患者。
vi）具有不受控的、未補償的心臟，肺或肝臟疾病，或不受控制的傳染病或糖尿病。
黑樹莓
從俄亥俄農場購買新鮮冷凍的BRBs（Jewel品種，2004年收獲），并冷凍運送到伊利諾斯州莫門斯的范德魯南農場，如所述進行冷凍干燥。BRBs的營養物分析和包裝詳見補充方法。
黑莓用量管理
一劑20g冷凍干燥的漿果粉末與約100mL水混合，每天口服3次（總共60g /d）持續1-9周。每天定期服用漿果粉3次，間隔6小時。60克漿果粉每天接近1.3磅新鮮BRB，相當于7％嚙齒動物樹莓粉飲食。發現BRB粉末在大鼠飲食中以2.5％至10％的濃度提供時，對大鼠結腸具有化學預防作用。
漿果處理前和漿液處理期間的評估
起初，給所有患者進行身體檢查，在此期間獲得他們的醫療/手術史，并且完成了乳酸脫氫酶（LDH），癌胚抗原（CEA），完全血細胞計數（CBC）和完全代謝組的實驗室測試。然后，他們參加了一次24小時的口頭食物召回，以便在用漿果粉治療之前建立富含酚類食物（包括漿果產品）的消費模式。在漿果治療期間，每周評估患者一次依從性和任何不良事件。在試驗期間，要求患者避免使用除黑莓粉之外的漿果類型。
組織和尿液收集
所有入選試驗的患者在進入試驗前都診斷為結腸直腸癌。 因為用于初始診斷的組織不可用于研究，所以有必要在漿果治療患者之前獲得另外的組織標本。最初，患者簽署了同意書，之后他們停止使用NSAIDs。大約5天后，從結直腸癌患者體內取三個活體樣本，每一個毗鄰于正常組織（距離腫瘤組織小于2nm的位置）和腫瘤組織。將每份活體樣本的一半置于10％福爾馬林緩沖液中，另一半在液氮中冷凍?；颊咴诓杉M織活檢后約24小時開始每天服用BRBs粉末，并直到手術去除腫瘤前12-36小時。在手術時，從每個患者體內取出毗鄰正常和腫瘤組織的另外3個活體樣本，并如預處理活檢所述那樣放置在緩沖的福爾馬林中或冷凍。所有組織標本由醫學病理學家W. Frankel博士在組織病理學上分類為正?；蚰[瘤組織。所有腫瘤均為腺瘤。
在基線水平和漿果處理后收集了治療前和治療后的尿液樣本（每個約50mL）。 為了確保漿果花色苷的穩定性，將樣本加入5％三氟乙酸降低PH至酸性后保存在-80℃。
測量結直腸組織和尿中的漿果花色苷
在補充方法中詳述了樣品制備和HPLC-MS / MS分析和花青素的定量。
DNA甲基化的分析
A. DNA提取和亞硫酸氫鹽轉化。相鄰的正常和腫瘤組織用于提取基因組DNA，如補充方法中所述。
B. 質量序列。高通量MassARRAY用于定量p16，PAX6a，SFRP2，SFRP5和WIF1的CpG島的甲基化水平，如補充方法中所詳述。
C. 焦磷酸測序。使用LINE-1重復元件亞硫酸氫鹽/焦磷酸測序來評估整體的甲基化水平，如補充方法中所詳述。
免疫組織化學染色和計算機輔助圖像分析
免疫組織化學染色程序和β-連環蛋白，E-鈣粘蛋白，c-Myc，Ki-67，TUNEL，p16，CD105或DNMT1的染色定量在補充方法中詳述。
統計分析
通過確定漿果治療前后和每個相對于基線的變量的百分比改變，來定量甲基化和免疫組織化學染色數據。通過Student’s t-檢驗比較治療前后平均值、百分比變化和花青素水平的差異。所有分析均為雙側的，小于0.05的P值被認為是顯著的。使用線性回歸確定甲基化的百分比改變和DNMT1表達百分比改變、漿果劑量和年齡變化之間的相關性。
結果
患者特征
20名患者參與試驗，其特征總結在表1中。17名患者來于俄亥俄州立大學，3名來自圣安東尼奧得克薩斯大學。20例患者中有17例為男性，平均年齡為59歲。6名患者有結腸癌（30％），另14名（70％）患有直腸癌。兩名患者有轉移性疾病。
漿果治療和依從性
患者口服樹莓粉治療1~9周?；颊邔{果治療的依從性非常好，基于返回的空袋和自我報告，每個患者都服用了規定日劑量的90%以上。漿果粉末通常耐受性良好，7名患者出現胃腸道的輕度干擾，即腹瀉和便秘，在2-3天內消退。在研究期間，BRB治療不改變患者LDH，CBC，CEA和代謝特征
分析尿液和結直腸組織中花青素
漿果治療前任何患者的尿液中都不存在花青素，20名患者漿果治療后尿液中檢測到4種花青素（補充表S1）。4種花青素的范圍在56.2~1822 pmol/ml之間。20名患者中的18個結直腸組織中也檢測到4種花青素，然而，量遠低于尿液中的量，范圍在1.7~2011.5 fmol/mg 組織。（補充表S1）。毗鄰正常組織中花青素含量299.9±754.9 fmol/mg，腫瘤組織55.4±60.8 fmol/mg（平均值±標準偏差）；相鄰正常組織中的花青素水平與腫瘤組織中的花青素水平沒有顯著差異（P = 0.21）。
BRBs對腫瘤抑制基因啟動子去甲基化和DNMT1蛋白表達的影響
來自所有20個患者的相鄰正常和結腸直腸腫瘤組織的聯合甲基化數據的初步分析表明，BRB治療不同時間段（1~9周;平均=3周）未能對SFRP2、PAX6a、p16、SFRP5和WIF1的啟動子甲基化產生顯著影響，也未能對結腸直腸腫瘤（腺癌）組織中的LINE-1重復元件產生顯著影響（圖1）。事實上，觀察到的唯一顯著效應是在毗鄰正常組織中SFRP2和SFRP5啟動子甲基化減少。從圖1顯而易見的是，漿果治療對毗鄰正常和腫瘤組織中的基因的啟動子甲基化的影響從一個患者到另一個患者是非常不同的。
然而，當患者基于下述方式分組時，觀察到了這些基因啟動子甲基化的顯著差異：（a）攝入的樹莓總量，（b）DNMT1蛋白表達的變化程度。來自毗鄰正常組織的分析的數據顯示在圖2中。N/H是指從接受平均83個漿果劑量（~4周的治療）的患者體內取得的毗鄰正常組織。N/L是指從接受平均52個漿果劑量（~2周的治療）的患者體內取得的毗鄰正常組織。圖2顯示與N/L組織相比，N/H組織中SFRP2和PAX6a腫瘤抑制基因以及DNMT1蛋白表達相對基線，甲基化百分比顯著降低。標記為“全部”的框表示，N/H組對比N/L組，所有5種腫瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）組合的甲基化水平降低。
圖3顯示出了來自接受不同劑量漿果的患者的結腸直腸腺癌的分析數據。T/H是指從接受平均85個漿果劑量（~4周的治療）的患者體內取得的腺癌。T/L是指從接受平均53個漿果劑量（~2周治療）的患者體內取得的腺癌。在T/H組腫瘤相對與T/L組腫瘤中，觀察到SFRP2，PAX6a和WIF1基因的甲基化變化以及DNMT1蛋白表達對于基線的百分比顯著降低。當將來自所有5種抑制基因的啟動子甲基化數據組合時，T/H腫瘤數據與T/L腫瘤數據有著顯著不同。這些結果表明腫瘤抑制基因的啟動子甲基化和DNMT1蛋白表達的變化程度受到攝入的BRB粉末的總劑量的影響。
結果
患者特征
20名患者參與試驗，其特征總結在表1中。17名患者來于俄亥俄州立大學，3名來自圣安東尼奧得克薩斯大學。20例患者中有17例為男性，平均年齡為59歲。6名患者有結腸癌（30％），另14名（70％）患有直腸癌。兩名患者有轉移性疾病。
漿果治療和依從性
患者口服樹莓粉治療1~9周?；颊邔{果治療的依從性非常好，基于返回的空袋和自我報告，每個患者都服用了規定日劑量的90%以上。漿果粉末通常耐受性良好，7名患者出現胃腸道的輕度干擾，即腹瀉和便秘，在2-3天內消退。在研究期間，BRB治療不改變患者LDH，CBC，CEA和代謝特征
分析尿液和結直腸組織中花青素
漿果治療前任何患者的尿液中都不存在花青素，20名患者漿果治療后尿液中檢測到4種花青素（補充表S1）。4種花青素的范圍在56.2~1822 pmol/ml之間。20名患者中的18個結直腸組織中也檢測到4種花青素，然而，量遠低于尿液中的量，范圍在1.7~2011.5 fmol/mg 組織。（補充表S1）。毗鄰正常組織中花青素含量299.9±754.9 fmol/mg，腫瘤組織55.4±60.8 fmol/mg（平均值±標準偏差）；相鄰正常組織中的花青素水平與腫瘤組織中的花青素水平沒有顯著差異（P = 0.21）。
BRBs對腫瘤抑制基因啟動子去甲基化和DNMT1蛋白表達的影響
來自所有20個患者的相鄰正常和結腸直腸腫瘤組織的聯合甲基化數據的初步分析表明，BRB治療不同時間段（1~9周;平均=3周）未能對SFRP2、PAX6a、p16、SFRP5和WIF1的啟動子甲基化產生顯著影響，也未能對結腸直腸腫瘤（腺癌）組織中的LINE-1重復元件產生顯著影響（圖1）。事實上，觀察到的唯一顯著效應是在毗鄰正常組織中SFRP2和SFRP5啟動子甲基化減少。從圖1顯而易見的是，漿果治療對毗鄰正常和腫瘤組織中的基因的啟動子甲基化的影響從一個患者到另一個患者是非常不同的。
然而，當患者基于下述方式分組時，觀察到了這些基因啟動子甲基化的顯著差異：（a）攝入的樹莓總量，（b）DNMT1蛋白表達的變化程度。來自毗鄰正常組織的分析的數據顯示在圖2中。N/H是指從接受平均83個漿果劑量（~4周的治療）的患者體內取得的毗鄰正常組織。N/L是指從接受平均52個漿果劑量（~2周的治療）的患者體內取得的毗鄰正常組織。圖2顯示與N/L組織相比，N/H組織中SFRP2和PAX6a腫瘤抑制基因以及DNMT1蛋白表達相對基線，甲基化百分比顯著降低。標記為“全部”的框表示，N/H組對比N/L組，所有5種腫瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）組合的甲基化水平降低。
圖3顯示出了來自接受不同劑量漿果的患者的結腸直腸腺癌的分析數據。T/H是指從接受平均85個漿果劑量（~4周的治療）的患者體內取得的腺癌。T/L是指從接受平均53個漿果劑量（~2周治療）的患者體內取得的腺癌。在T/H組腫瘤相對與T/L組腫瘤中，觀察到SFRP2，PAX6a和WIF1基因的甲基化變化以及DNMT1蛋白表達對于基線的百分比顯著降低。當將來自所有5種抑制基因的啟動子甲基化數據組合時，T/H腫瘤數據與T/L腫瘤數據有著顯著不同。這些結果表明腫瘤抑制基因的啟動子甲基化和DNMT1蛋白表達的變化程度受到攝入的BRB粉末的總劑量的影響。
在圖2B和3B的熱圖中，綠色和紅色分別描繪了甲基化的減少和增加。當比較這些數字時，如綠色相對量所顯示的證據，毗鄰的正常結直腸組織通常比結直腸腺癌組織對漿果誘導的啟動子去甲基化的相應更有利。此外，DNMT1蛋白表達和啟動子甲基化的變化之間存在正相關（圖4A，P=0.006，R2=0.181）。一般來說，用BRBs治療~4周（高劑量），不是~2周（低劑量），能導致毗鄰正常和腺瘤組織中啟動子甲基化減少，如圖4B所示（P=0.035，R2=0.118）。通過LINE-1重復元件亞硫酸氫鹽/焦磷酸測序測定的高劑量組和低劑量組并沒有引起毗鄰正常組織或結直腸腫瘤組織全甲基化水平相對基線的顯著變化（圖4c）。用高劑量或低劑量漿果（補充圖S1A）治療的患者的年齡沒有顯著差異，漿果誘導的啟動子甲基化變化非年齡依賴（補充圖S1B）。
結直腸組織對樹莓粉治療的應答不同
由于口服時暴露于BRBs化合物的情況，結腸組織可能不同于直腸組織，故我們相信毗鄰的正常和結腸腫瘤組織對漿果治療帶來的去甲基化的應答效應可能不同于毗鄰的正常和直腸腫瘤組織。圖4D描繪了高劑量治療組（N/H）和低劑量治療組（N/L）在毗鄰的正常結直腸組織中的所有5種腫瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）組合中，甲基化水平相對于基線的變化百分比。當比較兩個劑量組的毗鄰正常組織時，高劑量治療組相對于低劑量治療組，僅直腸組織中的甲基化變化是顯著不同的（圖4D，P = 0.011）。使用腫瘤標本獲得相似的結果，T/H治療組直腸腫瘤的甲基化水平變化與T/L組顯著不同（圖4E，P <0.0001）。 有趣的是，位于結腸中的T / L組腫瘤對BRB的響應比直腸中的更好。
BRBs對Wnt信號，細胞增殖，凋亡，血管生成和細胞周期調節的作用
使用定量免疫組化測量毗鄰正常和結直腸腫瘤組織蛋白的表達：包括同Wnt途徑相關的三種蛋白（β-連環蛋白，E-鈣粘蛋白，c-Myc）；同細胞增殖（Ki-67）相關的蛋白；同細胞凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）、細胞周期調節（p16）相關的蛋白。這些蛋白質的代表性染色顯示在圖5A中。來自所有20名患者的BRBs治療1-9周前后的數據組合表明，漿果保護性調節結直腸腫瘤組織中的β-連環蛋白、Ki-67、TUNEL、CD105和DNMT1，以及毗鄰正常組織中的CD105和DNMT1（圖5B）。
把這些組織生物標志物的效用作為攝入總劑量的函數來評價BRB時，發現它們也是有效的。在毗鄰正常組織中，高劑量（N/H；~4周治療）與低劑量（N/L；~2周）相比，漿果治療后導致β-連環蛋白表達的減少、E-鈣粘蛋白表達的增加（圖6A，P<0.05）。與N/L組相比，在N/H組伴隨著Ki-67蛋白表達的降低、TUNEL染色的增加（P <0.05）。在N/H和N/L兩組中，CD105降低、p16增加，但組間差異不顯著（P> 0.05）。
在結直腸腺癌中，相對于T/L組織，BRBs治療導致T/H組織中β-catenin、Ki-67和CD105蛋白的表達百分比相對于基線顯著降低，而TUNEL和p16的表達增加（圖6B）。同樣，這些數據表明對BRB的應答與累積漿果劑量有關。
由于口服時暴露于BRBs化合物的情況，結腸組織可能不同于直腸組織，故我們相信毗鄰的正常和結腸腫瘤組織對漿果治療帶來的去甲基化的應答效應可能不同于毗鄰的正常和直腸腫瘤組織。圖4D描繪了高劑量治療組（N/H）和低劑量治療組（N/L）在毗鄰的正常結直腸組織中的所有5種腫瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）組合中，甲基化水平相對于基線的變化百分比。當比較兩個劑量組的毗鄰正常組織時，高劑量治療組相對于低劑量治療組，僅直腸組織中的甲基化變化是顯著不同的（圖4D，P = 0.011）。使用腫瘤標本獲得相似的結果，T/H治療組直腸腫瘤的甲基化水平變化與T/L組顯著不同（圖4E，P <0.0001）。 有趣的是，位于結腸中的T / L組腫瘤對BRB的響應比直腸中的更好。
BRBs對Wnt信號，細胞增殖，凋亡，血管生成和細胞周期調節的作用
使用定量免疫組化測量毗鄰正常和結直腸腫瘤組織蛋白的表達：包括同Wnt途徑相關的三種蛋白（β-連環蛋白，E-鈣粘蛋白，c-Myc）；同細胞增殖（Ki-67）相關的蛋白；同細胞凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）、細胞周期調節（p16）相關的蛋白。這些蛋白質的代表性染色顯示在圖5A中。來自所有20名患者的BRBs治療1-9周前后的數據組合表明，漿果保護性調節結直腸腫瘤組織中的β-連環蛋白、Ki-67、TUNEL、CD105和DNMT1，以及毗鄰正常組織中的CD105和DNMT1（圖5B）。
把這些組織生物標志物的效用作為攝入總劑量的函數來評價BRB時，發現它們也是有效的。在毗鄰正常組織中，高劑量（N/H；~4周治療）與低劑量（N/L；~2周）相比，漿果治療后導致β-連環蛋白表達的減少、E-鈣粘蛋白表達的增加（圖6A，P<0.05）。與N/L組相比，在N/H組伴隨著Ki-67蛋白表達的降低、TUNEL染色的增加（P <0.05）。在N/H和N/L兩組中，CD105降低、p16增加，但組間差異不顯著（P> 0.05）。
在結直腸腺癌中，相對于T/L組織，BRBs治療導致T/H組織中β-catenin、Ki-67和CD105蛋白的表達百分比相對于基線顯著降低，而TUNEL和p16的表達增加（圖6B）。同樣，這些數據表明對BRB的應答與累積漿果劑量有關。
討論
該研究的結果表明，用BRBs治療的結腸直腸癌患者后，導致結直腸腺癌和毗鄰正常組織中的遺傳和表觀遺傳生物標志物的陽性調節。分析生物標志物如Ki-67，TUNEL，β-catenin，CD105和DNMT1的免疫組織化學數據表明，這些標志物在BRBs治療后的所有20名患者的組織中被保護性調節。相比之下，DNA甲基化標記物的陽性調節僅發生在用BRB治療平均4周（高劑量）的患者的組織中，表明漿果治療必須發生更長的時間段才起效。這些差異的原因可能與以下事實有關：包含多種細胞類型的全組織標本被用于甲基化研究，而免疫組織化學數據主要來自對上皮的分析。因此，如果漿果的影響在上皮中比在其他組織（例如基質）中更明顯，則可以預期使用免疫組織化學標記更容易地檢測漿果效應。還有可能的是，DNA甲基轉移酶如DNMT1的抑制可能僅發生在用漿果長時間治療后。這些觀察表明BRBs在長期的II和III臨床試驗條件下，可能有效調節腫瘤抑制基因的啟動子甲基化，此時可能需要漿果治療幾個月到幾年時間。還應指出，雖然我們盡力平等地招募男人和女人參加我們的實驗，但我們發現男人更樂意參與。然而，我們將作出更多努力，以減少今后實驗中的性別不平衡。
目前的研究結果表明：拋除其它作用機理，BRBs可能具有抑制DNA甲基化的潛力。當以高的日劑量向人口服給藥時，BRB引起很小或沒有毒性，這使得它非常適合用作化學預防。此外最近研究得出，在家族性腺瘤性息肉病患者當中口服施用BRBs粉末（60g/d，相當于約1.3磅新鮮漿果）9個月，僅在一些患者中產生輕微的胃腸道紊亂，在2 -3天后消除。
該研究的結果表明，用BRBs治療的結腸直腸癌患者后，導致結直腸腺癌和毗鄰正常組織中的遺傳和表觀遺傳生物標志物的陽性調節。分析生物標志物如Ki-67，TUNEL，β-catenin，CD105和DNMT1的免疫組織化學數據表明，這些標志物在BRBs治療后的所有20名患者的組織中被保護性調節。相比之下，DNA甲基化標記物的陽性調節僅發生在用BRB治療平均4周（高劑量）的患者的組織中，表明漿果治療必須發生更長的時間段才起效。這些差異的原因可能與以下事實有關：包含多種細胞類型的全組織標本被用于甲基化研究，而免疫組織化學數據主要來自對上皮的分析。因此，如果漿果的影響在上皮中比在其他組織（例如基質）中更明顯，則可以預期使用免疫組織化學標記更容易地檢測漿果效應。還有可能的是，DNA甲基轉移酶如DNMT1的抑制可能僅發生在用漿果長時間治療后。這些觀察表明BRBs在長期的II和III臨床試驗條件下，可能有效調節腫瘤抑制基因的啟動子甲基化，此時可能需要漿果治療幾個月到幾年時間。還應指出，雖然我們盡力平等地招募男人和女人參加我們的實驗，但我們發現男人更樂意參與。然而，我們將作出更多努力，以減少今后實驗中的性別不平衡。
目前的研究結果表明：拋除其它作用機理，BRBs可能具有抑制DNA甲基化的潛力。當以高的日劑量向人口服給藥時，BRB引起很小或沒有毒性，這使得它非常適合用作化學預防。此外最近研究得出，在家族性腺瘤性息肉病患者當中口服施用BRBs粉末（60g/d，相當于約1.3磅新鮮漿果）9個月，僅在一些患者中產生輕微的胃腸道紊亂，在2 -3天后消除。
雖然全DNA低甲基化同癌癥細胞中導致染色質不穩定的染色質重組和核解體密切關聯，但全DNA低甲基化在動物體的影響一直有爭議。例如，與動物體腸腫瘤發生的總體抑制相反，低甲基化導致多灶性肝腫瘤的發展。這些結果清楚地證明DNA低甲基化對腸和肝癌產生的相反作用。在人類中，一項研究癌癥細胞系全低甲基化，包括乳腺癌，中樞神經系統，結腸，白血病，肝，肺，卵巢和前列腺的研究結果顯示，85％的測試細胞系（51/60）都是低甲基化的。有意思的是，當結直腸癌與其毗鄰組織比較時，結直腸癌細胞全甲基化是高度可變的，可以增加、不變或降低；在具有微衛星不穩定的癌癥中全低甲基化部分逆轉，這也許反應了癌癥進展有其它路徑。因此，全DNA低甲基化在癌癥中的概念可能太過簡化；致癌作用中全DNA甲基化模式的改變是由于器官和腫瘤類型的特異性。DNA甲基化抑制劑引起啟動子和全局重復序列中的低甲基化，因此它們發揮治療活性。
此外，根據Issa（人名）的研究，盡管腫瘤抑制基因的去甲基化可能具有有益的作用，癌基因的甲基化降低可導致它們的再活化和隨后的不良作用。然而，低甲基化劑的治療效果這可能是基于這樣的事實：比起正常成熟細胞，腫瘤細胞更依賴于基因沉默以保持其表型。因此，降低甲基化的總體效果似乎是積極的。此外，甲基化是年齡相關的，并且年齡相關的甲基化似乎是基因和組織特異性的。然而，一些基因（例如p16、SFRP2、與DNA修復相關基因）的甲基化不受年齡的影響；而是它們的甲基化水平隨著癌癥進展而增加。結直腸癌尤其如此。
在本研究中，BRBs對SFRP2、SFRP5、WIF1、p16和PAX6a基因的啟動子甲基化顯示不同的影響。例如，盡管BRB降低了N/H相對N/L組中SFRP2和PAX6a基因的甲基化（圖2），但是它們對同組中其他3種基因的甲基化沒有影響。因此，看來BRBs對不同基因的甲基化的作用表現出一些選擇性；但是，數據是初步的，且該作用的機制是未知的。
BRBs對基因去甲基化的影響可能是通過將漿果活性化合物局部吸收到結直腸組織中。這通過在漿果治療后的結直腸組織中BRB花青素的檢測（盡管處于低水平）來證明?；诨ㄇ嗨氐幕ㄇ嗨氐拇x物包括原兒茶酸（細胞培養中的主要降解產物），以及2,4-二羥基苯甲酸和2,4,6-三羥基苯甲酸。該研究報道了50mM的原兒茶酸發揮抗氧化活性，而不是其他兩個代謝產物。我們正在確定這些代謝物是否可以在動物和人類的血液中檢測到?；颊呓Y直腸組織中檢出的花色素含量變化巨大（1.7~2011.5 fmol/mg），這可能是由于患者術前（12~36h）最后一次給藥是在不同時間。因此，生物標志物數據不能與花青素水平相關。藥代動力學研究表明，在口服施用漿果粉末后，BRB花青素分別在1和4小時時在血液和尿液中達到峰值水平。因此，可以預期在手術前長達12-36小時食用漿果的患者結直腸組織中花色素水平的大差異。
致癌作用的“場效應”模型表明，與腫瘤毗鄰的細胞至少存在腫瘤本身中存在的一些遺傳改變。事實上，毗鄰正常組織中的表觀遺傳改變與人類結腸和乳腺中的癌癥進展相關。然而，如圖1,2,5和6所示，BRB帶來腫瘤抑制基因的去甲基化和相鄰“正常”結直腸組織中的細胞增殖和凋亡生物標志物的保護性調節，其可以很好地將這些組織恢復到更高程度的“正常”。
總之，我們的研究結果表明BRBs保護性調節結直腸癌患者組織中基因和表觀遺傳的生物標志物。漿果似乎對Wnt通路上游腫瘤抑制基因（SFRP2和WIF1）去甲基化，并保護性調節Wnt通路下游的基因（b-連環蛋白，E-鈣粘蛋白）的表達?；蛉ゼ谆赡苁荄NMT1抑制的結果，雖然其他甲基轉移酶也可能受到影響。結腸和直腸組織對漿果治療表現出不同響應；特別是直腸癌患者短期服用BRBs（~2周）已經降低了應答。這表明長期服用漿果治療結直腸癌患者可能是有益的。它還顯示了，如果開發用于將漿果局部遞送至直腸組織的方法，則BRB可能在直腸腫瘤患者中更有效。
雖然BRBs對腫瘤抑制基因去甲基化的能力得到數據的支持，初級終點的事實；即20名患者組織去甲基化總體上并不是陽性，意味著需要謹慎解釋數據。此外，鑒于甲基化不是結直腸癌化學預防的有效終點，必須謹慎地推斷這些結果。雖然我們不推薦漿果用于癌癥治療，當然不能代替標準的治療方法，但是它們可以被考慮與其它治療方式（例如化療，免疫療，放射療和/或手術）組合使用?；蛘?，確定在結直腸癌治療后常規地進行BRBs的飲食消費是否降低復發性疾病的風險將是十分有趣的。
致謝
我們感謝Sara Olivarri幫助患者在德克薩斯大學圣安東尼奧大學進行試驗，我們還感謝俄亥俄州立大學的綜合癌癥中心組織采購共享資源（CCCTPSR）處理這項研究的標本。最后，我們感謝所有患者參與此試驗。
原文鏈接：
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/17/3/598.full-text.pdf
此外，根據Issa（人名）的研究，盡管腫瘤抑制基因的去甲基化可能具有有益的作用，癌基因的甲基化降低可導致它們的再活化和隨后的不良作用。然而，低甲基化劑的治療效果這可能是基于這樣的事實：比起正常成熟細胞，腫瘤細胞更依賴于基因沉默以保持其表型。因此，降低甲基化的總體效果似乎是積極的。此外，甲基化是年齡相關的，并且年齡相關的甲基化似乎是基因和組織特異性的。然而，一些基因（例如p16、SFRP2、與DNA修復相關基因）的甲基化不受年齡的影響；而是它們的甲基化水平隨著癌癥進展而增加。結直腸癌尤其如此。
在本研究中，BRBs對SFRP2、SFRP5、WIF1、p16和PAX6a基因的啟動子甲基化顯示不同的影響。例如，盡管BRB降低了N/H相對N/L組中SFRP2和PAX6a基因的甲基化（圖2），但是它們對同組中其他3種基因的甲基化沒有影響。因此，看來BRBs對不同基因的甲基化的作用表現出一些選擇性；但是，數據是初步的，且該作用的機制是未知的。
BRBs對基因去甲基化的影響可能是通過將漿果活性化合物局部吸收到結直腸組織中。這通過在漿果治療后的結直腸組織中BRB花青素的檢測（盡管處于低水平）來證明?；诨ㄇ嗨氐幕ㄇ嗨氐拇x物包括原兒茶酸（細胞培養中的主要降解產物），以及2,4-二羥基苯甲酸和2,4,6-三羥基苯甲酸。該研究報道了50mM的原兒茶酸發揮抗氧化活性，而不是其他兩個代謝產物。我們正在確定這些代謝物是否可以在動物和人類的血液中檢測到?；颊呓Y直腸組織中檢出的花色素含量變化巨大（1.7~2011.5 fmol/mg），這可能是由于患者術前（12~36h）最后一次給藥是在不同時間。因此，生物標志物數據不能與花青素水平相關。藥代動力學研究表明，在口服施用漿果粉末后，BRB花青素分別在1和4小時時在血液和尿液中達到峰值水平。因此，可以預期在手術前長達12-36小時食用漿果的患者結直腸組織中花色素水平的大差異。
致癌作用的“場效應”模型表明，與腫瘤毗鄰的細胞至少存在腫瘤本身中存在的一些遺傳改變。事實上，毗鄰正常組織中的表觀遺傳改變與人類結腸和乳腺中的癌癥進展相關。然而，如圖1,2,5和6所示，BRB帶來腫瘤抑制基因的去甲基化和相鄰“正常”結直腸組織中的細胞增殖和凋亡生物標志物的保護性調節，其可以很好地將這些組織恢復到更高程度的“正常”。
總之，我們的研究結果表明BRBs保護性調節結直腸癌患者組織中基因和表觀遺傳的生物標志物。漿果似乎對Wnt通路上游腫瘤抑制基因（SFRP2和WIF1）去甲基化，并保護性調節Wnt通路下游的基因（b-連環蛋白，E-鈣粘蛋白）的表達?；蛉ゼ谆赡苁荄NMT1抑制的結果，雖然其他甲基轉移酶也可能受到影響。結腸和直腸組織對漿果治療表現出不同響應；特別是直腸癌患者短期服用BRBs（~2周）已經降低了應答。這表明長期服用漿果治療結直腸癌患者可能是有益的。它還顯示了，如果開發用于將漿果局部遞送至直腸組織的方法，則BRB可能在直腸腫瘤患者中更有效。
雖然BRBs對腫瘤抑制基因去甲基化的能力得到數據的支持，初級終點的事實；即20名患者組織去甲基化總體上并不是陽性，意味著需要謹慎解釋數據。此外，鑒于甲基化不是結直腸癌化學預防的有效終點，必須謹慎地推斷這些結果。雖然我們不推薦漿果用于癌癥治療，當然不能代替標準的治療方法，但是它們可以被考慮與其它治療方式（例如化療，免疫療，放射療和/或手術）組合使用?；蛘?，確定在結直腸癌治療后常規地進行BRBs的飲食消費是否降低復發性疾病的風險將是十分有趣的。
致謝
我們感謝Sara Olivarri幫助患者在德克薩斯大學圣安東尼奧大學進行試驗，我們還感謝俄亥俄州立大學的綜合癌癥中心組織采購共享資源（CCCTPSR）處理這項研究的標本。最后，我們感謝所有患者參與此試驗。
原文鏈接：
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/17/3/598.full-text.pdf
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