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黑樹莓花青素靶向調控miR-338-5p/SIRT1 相關信號通路對結直腸癌的化學預防作用
發表于：2019-01-02 作者：admin 來源：本站 點擊量：7164
郭 君 1，毛麗萍1，李倩倩1，張秋華2，李曉龍3，畢秀麗1*
1. 遼寧大學生命科學院生物技術系，遼寧沈陽 110036
2. 遼寧中醫藥大學基礎醫學院藥理系，遼寧 沈陽 110847
3. 深圳福山生物科技有限公司，廣東深圳 518000
摘 要：
目的：研究 miR-338-5p/SIRT1 相關信號通路在黑樹莓花青素化學預防結直腸癌中的作用。方法：小鼠分為健康對照組，氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的炎癥相關性結直腸癌小鼠模型組，AOM/DSS 誘導聯合黑樹莓花青素處理組。利用miRNA 基因芯片篩選差異表達miRNAs，選miR-338-5p，采用RT-qPCR 確認miR-338-5p 在小鼠結腸組織及在人結直腸癌細胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 中的mRNA 表達，生物信息學軟件預測miR-338-5p和SIRT1 靶向調節關系。Western blotting 檢測小鼠結腸組織中SIRT1 蛋白及其下游mTOR 等信號通路相關蛋白表達。結果：miRNA 基因芯片分析發現，與常規飲食的模型小鼠相比，喂食添加黑樹莓花青素的模型小鼠結直腸腫瘤組織中miR-338-5p表達量顯著減少，進一步研究幾種結腸癌細胞系，確認了miR-338-5p 表達趨勢；黑樹莓花青素處理結直腸癌細胞，miR-338-5p的表達能夠顯著降低。生物信息學預測miR-338-5p 和SIRT1 存在靶向調節關系。機制研究發現黑樹莓花青素可以促進腸上皮細胞SIRT1 蛋白的表達，并對其下游mTOR 等相關信號通路分子蛋白水平具有調控作用。結論：黑樹莓花青素可能通過靶向調控miR-338-5p/SIRT1 相關信號通路而發揮對結直腸癌的化學預防作用，進而為結直腸癌提供新的化學預防策略。
目的：研究 miR-338-5p/SIRT1 相關信號通路在黑樹莓花青素化學預防結直腸癌中的作用。方法：小鼠分為健康對照組，氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的炎癥相關性結直腸癌小鼠模型組，AOM/DSS 誘導聯合黑樹莓花青素處理組。利用miRNA 基因芯片篩選差異表達miRNAs，選miR-338-5p，采用RT-qPCR 確認miR-338-5p 在小鼠結腸組織及在人結直腸癌細胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 中的mRNA 表達，生物信息學軟件預測miR-338-5p和SIRT1 靶向調節關系。Western blotting 檢測小鼠結腸組織中SIRT1 蛋白及其下游mTOR 等信號通路相關蛋白表達。結果：miRNA 基因芯片分析發現，與常規飲食的模型小鼠相比，喂食添加黑樹莓花青素的模型小鼠結直腸腫瘤組織中miR-338-5p表達量顯著減少，進一步研究幾種結腸癌細胞系，確認了miR-338-5p 表達趨勢；黑樹莓花青素處理結直腸癌細胞，miR-338-5p的表達能夠顯著降低。生物信息學預測miR-338-5p 和SIRT1 存在靶向調節關系。機制研究發現黑樹莓花青素可以促進腸上皮細胞SIRT1 蛋白的表達，并對其下游mTOR 等相關信號通路分子蛋白水平具有調控作用。結論：黑樹莓花青素可能通過靶向調控miR-338-5p/SIRT1 相關信號通路而發揮對結直腸癌的化學預防作用，進而為結直腸癌提供新的化學預防策略。
關鍵詞：黑樹莓；花青素；結直腸癌；miR-338-5p；SIRT1；化學預防
中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：0253 - 2670(2018)04 - 0853 - 06
微小 RNA（micro RNAs，miRNAs）是在動植物中發現的一個大小為19～25 bp 非蛋白質編碼的小分子RNA 家族。通過與靶基因mRNA 作用，使其在轉錄后的翻譯過程被抑制或直接被降解致其蛋白表達水平降低，從而參與多種生物學過程，如細胞發育、增殖、分化、凋亡以及代謝等[1-3]。miRNAs也可以發揮癌基因或抑癌基因作用參與人體多種腫瘤的發生和發展。結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家報告的發病率最高，其發病率在我國呈現上升趨勢。研究發現，多個miRNAs 在結直腸癌中表達異常，在結直腸癌的發生、發展中發揮重要作用。過表達miR-155-5p 可增加結腸癌增殖和侵襲能力[4]。miR-433 通過調節結直腸癌中的結直腸癌轉移相關基因1（MACC1）來降低細胞活力并促進細胞凋亡[5]。miR-338-5p 為miR-338 的亞型之一，miR-338 及其亞型在胃癌[6-7]和神經母細胞瘤[8]中表達下調，在宮頸癌[9]和胰腺癌[10]中高表達，在結直腸癌中，Sun 等[11]發現miR-338-3p 低表達，通過作用于SMO（smoothened，一種原癌基因）抑制結直腸癌的細胞增殖。在肝癌中，有研究發現miR-338-5p 表達上調，可以作為肝細胞癌生物標記物[12]。但是miR-338-5p 在結直腸癌中的研究較少。
黑樹莓（black raspberry，BRB）屬薔薇科勾懸子屬漿果，是北美膳食中食用量較大的水果，在我國其作為水果也越來越多的受到人們的喜愛。研究證明黑樹莓中含有大量的活性物質，如酚酸類、黃酮類、原花青素和鞣質等酚類化合物[13]。酚類化合物已被證實具有促進脂類代謝及自由基清除等生理作用，人們已經獲得證據表明酚類化合物在預防人類某些疾病方面有一定功效，如預防心腦血管疾病、癌癥等方面[14]。前期研究證明黑樹莓中原花青素和鞣花酸類含量豐富，對于癌癥的預防有很好的作用，尤其對結直腸癌[15-16]、食管癌[17]等有一定的預防及治療作用。但是黑樹莓能否通過影響miRNAs 表達發揮對結直腸癌的預防作用尚未見報道。本研究利用化學致癌物氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）聯合誘導的炎癥相關性結直腸癌小鼠模型，飲食給予黑樹莓花青素，考察黑樹莓花青素對結腸組織和結直腸癌細胞中表達異常的miRNAs 的影響，選定miR-338-5p 進行后續研究，初步探索miR-338-5p 在結直腸癌化學預防中的作用機制。此研究將為黑樹莓的腫瘤化學預防作用和作用機制提供新的理論依據，miR-338-5p 的研究有望成為結直腸癌的化學預防新靶點。
1 材料
1.1 實驗動物
C57 小鼠雄性，體質量18～22 g，遼寧長生生物技術有限責任公司，合格證號SCXK-（遼）-2015-0001。
1.2 實驗細胞
10 代以內人結直腸癌細胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480，來源于中國科學院北京協和腫瘤醫院。
1.3 主要試劑
MiRNA cDNA Synthesis Ki（t CW2141，25Rxns）、miRNA Real-Time PCR Assay Kit （ CW2142 ，100Rxns）購自北京康為世紀生物科技有限公司；Anti-SIRT1 抗體（D121218-0200）、Anti-SIRT3 抗體（D221219-0200）、Anti-HIF-1α 抗體（D262108-0010）購自上海生工生物有限公司；Anti-β-actin 抗體（AB10024 ） 購自BBI 公司；Anti-VEGF 抗體（GTX102643）購自GeneteX 公司；Anti-E-cadherin抗體（3195s）購自Cell Signaling Technology 公司；Anti-mTOR 抗體（BS3611）購自Bioword Technology公司；Trizol（B900044-100）購自BBI 公司；RIPA裂解液（R0010）購自索萊寶生物科技有限公司；AOM（A5486）和DSS（42867）購自Sigma 公司。
1.4 主要儀器
Applied Biosystems 7500 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司；高速冷凍離心機購自安徽中科中佳科學儀器有限公司；化學發光儀購自以色列DNR公司。
2 方法
2.1 黑樹莓花青素的提取
黑樹莓花青素由天津尖峰天然產物提取有限責任公司提?。ㄅ?0130901），質量分數＞90%。提取步驟簡述如下：冷凍干燥的黑樹莓凍干粉在35 ℃用乙醇-水（75∶25）萃取3 h，得到粗酚提取液。將所得提取物濾過，色譜分離，經Sephadex 進一步色譜，通過制備型HPLC 純化得到提純的黑樹莓花青素。
2.2 實驗動物模型制備
C57 小鼠（18～22 g），適應1 周后，開始造模，首先在第1、8 天小鼠單次ip AOM（10 mg/kg），然后2% DSS 攝水進行3 個循環，即1、4、7 周分別給予2% DSS 攝水，其他時間均為正常飲水，實驗周期為12 周，檢測小鼠腸中的腫瘤情況以確認模型是否成功。該研究由遼寧中醫藥大學倫理委員會批準。模型成功小鼠分2 組，模型組為AOM/DSS誘導的結直腸癌小鼠（10 只），給予正常飼料；黑樹莓花青素組為AOM/DSS 誘導的結直腸癌小鼠（10 只），自造模開始給予含7.0 μmol/g 黑樹莓花青素飼料，直到造模結束；另取正常喂養狀況良好的C57 小鼠（7 只），給予正常飼料為對照組。在第12周造模結束，將小鼠斷頸處死，另取結腸組織、提取上皮細胞−80 ℃保存。7.0 μmol/g 黑樹莓花青素劑量的選擇參照前期研究中10%黑樹莓凍干粉的劑量，結合花青素的提取比例計算而來[16]。
2.3 人結直腸癌細胞處理、收集
Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 細胞復蘇，待細胞生長到90%貼壁時取約2×105 個細胞接種于6 孔板，每孔補充培養基至2 mL。實驗分為對照組，黑樹莓花青素低劑量（25 μg/mL）組和高劑量（50μg/mL）組，藥物處理細胞48 h，收集細胞備用。
2.4 miRNA 基因芯片檢測
取結腸組織進行 Agilent Mouse miRNA（8*60K，Design ID：070155）芯片檢測，完成10 個樣本檢測和分析。樣品總RNA 利用NanoDrop ND-2000（ Thermo Scientific 公司） 定量并經AgilentBioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測RNA完整性。RNA 質檢合格后，對樣本進行標記、芯片的雜交以及洗脫等處理，此步驟是參照芯片標準流程嚴格操控的。第1 步：將總RNA 去磷酸化，變性后進一步用Cyanine-3-CTP（Cy3）標記。第2 步：將標記好的RNA 純化后與芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies 公司）掃描得到原始圖像。第3 步：采用Feature Extraction軟件（version10.7.1.1，Agilent Technologies 公司）處理原始圖像提取原始數據。接著利用Genespring軟件（version13.1，Agilent Technologies 公司）進行quantile 標準化和后續處理。最后，對差異miRNAs進行非監督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異miRNAs 在不同樣本間的表達模式。上述miRNA基因芯片檢測分析由上海歐意公司完成。
2.5 實 時 熒光定量PCR （ RT-qPCR ） 檢測miR-338-5p 的表達量
RT-qPCR 檢測組織和細胞miR-338-5p 的表達量，組織及細胞用Trizol 試劑提取總RNA，參照micro RNA 逆轉錄試劑盒說明書行逆轉錄，RT-qPCR 反應采用SYBR 染料法，選用U6 作為內參基因，反應條件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個循環。采用2−ΔΔCt 法計算miR-338-5p 相對表達量，mmu-miR-338-5p 引物序列：5’-GAACAATATCCTGGTGCTGAGTG-3’；hsamiR-338-5p 引物序列：5’-TGAACAATATCCTGGTGCTGAGTG-3’。
2.6 生物信息學分析miR-338-5p 的靶基因
利 用 TargetScan （ http://www.targetscan.org/vert_71/）、miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）在線軟件分析miR-338-5p 和沉默信息調節因子1（SIRT1）的靶向關系。
2.7 Western blotting 檢測相關蛋白表達
蛋白質印跡法檢測結腸癌組織上皮細胞SIRT1蛋白及其下游mTOR 等相關信號通路分子蛋白。結腸組織上皮細胞，加入RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制劑提取總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。20 μg總蛋白上樣，12% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜，封閉，孵育一抗、二抗，凝膠成像系統拍照、分析。
2.8 統計學方法
采用SPSS 19.0 統計軟件分析，組間比較采用t檢驗及方差分析，Image J 和Graphpad Prism 5.0進行統計做圖。
3 結果
3.1 miRNA 基因芯片結果
從小鼠結腸組織miRNA 基因芯片結果發現，模型組和黑樹莓花青素組的小鼠結腸組織中所有miRNAs 表達特征共發現6 個差異表達miRNAs（差異倍數＞2.5），將差異表達miRNAs 聚類分析。miR-338-5p 在模型組小鼠中高水平表達，在給予黑樹莓花青素飲食12 周后，其表達水平顯著下調（圖1），提示miR-338-5p 在黑樹莓花青素抑制腫瘤形成和化學預防中可能發揮作用。
3.2 小鼠結腸組織和結直腸癌細胞系miR-338-5p表達量
為了進一步驗證miRNA 基因芯片結果。通過RT-qPCR 檢測小鼠結腸組織和結直腸癌細胞系中miR-338-5p 的表達量變化。同對照組比較，模型組小鼠組織中miR-338-5p 顯著上調；喂食黑樹莓花青素組小鼠組織中miR-338-5p 顯著下調（圖2-A）。體外細胞水平，黑樹莓花青素處理后結直腸癌細胞miR-338-5p 表達量同樣下調（圖2-B），與基因芯片結果相符。提示miR-338-5p 表達參與了黑樹莓花青素結直腸腫瘤的化學預防作用。
圖 1 小鼠結腸組織miRNA 芯片聚類分析模型組和黑樹莓花青素組差異表達 miRNAs
3.3 生物統計軟件預測SIRT1 基因是MiR-338-5p的靶基因
進 一 步 利用生物信息學軟件分析預測，miR-338-5p 的種子區域和SIRT1 基因3’UTR 存在互補配對的序列（圖3），因此生物信息學分析認為SIRT1 可能是miR-338-5p 的靶基因。
3.4 小鼠結腸組織上皮細胞SIRT1 蛋白及mTOR等相關信號通路分子檢測
進一步對上述生物信息分析預測結果進行驗證，考察了SIRT1 蛋白及其介導的下游信號通路相關分子的表達。結果（圖4）發現，與模型組相比，黑樹莓花青素組SIRT1 蛋白、E-cadherin 蛋白表達升高，下游相關信號通路相關分子mTOR、SIRT3、HIF-1α的表達下降。SIRT1 抑制結直腸癌的發生和發展，SIRT1 表達上調抑制mTOR 蛋白表達[18]。mTOR 可以從轉錄水平激活HIF-1α 的表達，所以相應的HIF-1α表達下調[19]。HIF-1α 可以通過控制VEGF 的編碼基因來調節VEGF 的表達，HIF-1α 表達受抑制，相應VEGF 的表達也受抑制[20]。所以，當前研究提示黑樹莓花青素可以通過影響miR-338-5p，進而調控SIRT1蛋白的表達，調控結直腸癌的發生發展。
3.5 黑樹莓花青素在結直腸癌中發揮化學預防作用的機制
經過上述實驗驗證，推測在結直腸癌的發生發展中，黑樹莓花青素能通過多重作用激活SIRT1 及其介導的下游相關信號通路分子來發揮對結直腸癌的化學預防作用。在此過程中miR-338-5p 作為黑樹莓和SIRT1 相關信號通路的中間信使，傳遞黑樹莓花青素化學預防作用，并通過自身的靶向功能，作用于SIRT1 相關信號通路（圖5）。
經過上述實驗驗證，推測在結直腸癌的發生發展中，黑樹莓花青素能通過多重作用激活SIRT1 及其介導的下游相關信號通路分子來發揮對結直腸癌的化學預防作用。在此過程中miR-338-5p 作為黑樹莓和SIRT1 相關信號通路的中間信使，傳遞黑樹莓花青素化學預防作用，并通過自身的靶向功能，作用于SIRT1 相關信號通路（圖5）。
4 討論
酚類化合物是植物體極為重要的次生代謝產物，由于酚類物質在預防疾病方面的發現，作為化學預防劑廣泛應用，劉秀芳等[21]研究證明了茶多酚抑制結直腸癌細胞生長。杏仁中鞣花酸含量豐富，鞣花酸在諸多物質中顯示出具有抗癌性，通過影響信號轉導通路抑制結直腸癌細胞增殖[22-23]。黑樹莓中原花青素和鞣花酸類含量豐富，在前期的研究中發現黑樹莓花青素能抑制結直腸癌細胞的增殖，遷移，抑制腫瘤的發生發展[24]。本研究中，小鼠組織miRNA基因芯片研究結果及體外細胞體系深入機制研究發現：黑樹莓花青素能通過下調miR-338-5p，從而激活miR-338-5p 的靶蛋白SIRT1 及其介導的下游相關信號通路分子，來發揮對結直腸癌的化學預防作用。
本研究中發現利用RT-qPCR 檢測miR-338-5p在結直腸癌組織相比于正常組織表達量升高，miR-338-5p 作為癌基因發揮作用，同時生物信息學的預測發現miR-338-5p 與SIRT1 可能是有靶向關系的。SIRT-1 是NAD＋依賴性III 類組蛋白脫乙酰酶的成員，其參與多種病理生理過程，例如抗炎，調節細胞生長和代謝，抗癌發生[25-27]。SIRT1 使β-catenin 脫乙?；?，從而抑制β-catenin 的激活轉錄和細胞增殖[28]。SIRT3 的作用與SIRT1 相反。SIRT1的升高會降低mTOR 表達量[16]。mTOR 可以從轉錄水平激活HIF-1α 的表達[17]。HIF-1α 在結直腸癌增殖、侵襲和轉移的發生中的表達，HIF-1α 通過控制VEGF 的編碼基因從而來控制VEGF 的表達，進而促進血管生成[18]。SIRT1 能夠抑制結直腸癌的發展和進展。本研究中相比于AOM/DSS 模型組，黑樹莓組結直腸組織中SIRT1 蛋白表達量提高，下游mTOR 等信號通路相關蛋白表達量也發生變化，黑樹莓能通過某種方式調控SIRT1 信號通路，而且黑樹莓降低miR-338-5p 表達同時提高SIRT1 蛋白表達，同樣證實miR-338-5p 與SIRT1 可能是有靶向關系的。
綜上所述，黑樹莓花青素能通過調控miR-338-5p/SIRT1 信號通路影響結直腸癌的發生發展，從而發揮對結直腸癌的化學預防作用，上述研究結果為結腸直腸癌提供新的化學預防和治療策略。
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