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蘿卜硫素通過Nrf2信號傳導預防年齡相關的心臟和肌肉功能障礙
發表于：2020-10-29 作者：admin 來源：本站 點擊量：6332
摘要：
年齡相關的線粒體功能障礙和氧化損傷是多種健康問題的主要原因，包括肌肉減少癥和心血管疾?。–VD）。盡管Nrf2（一種調節細胞保護性基因表達的轉錄因子）在肌肉病變中的作用仍不清楚，但它在肌肉減少癥和CVD中均顯示出有益的特性。蘿卜硫素（SFN）是一種激活Nrf2相關細胞保護基因的天然化合物，可對包括CVD在內的多種疾病提供保護，并且正在進行從預防癌癥到降低胰島素抵抗的各個階段臨床試驗。這項研究旨在確定SFN是否可以預防與年齡相關的心臟和骨骼肌功能喪失。對2個月大和21至22個月大的小鼠進行常規嚙齒動物飲食或補充SFN的飲食12周。在研究完成時，檢測了骨骼肌和心臟功能、線粒體功能和Nrf2活性。我們的研究表明，與年輕組小鼠相比，老年對照組小鼠的Nrf2活性和線粒體功能顯著下降，并且骨骼肌和心臟功能喪失。在老年小鼠中，SFN恢復了Nrf2活性、線粒體功能、心臟功能、運動能力、葡萄糖耐量以及骨骼肌衛星細胞的激活/分化。我們的結果表明，與年齡相關的Nrf2信號傳導活性下降和與之相關的線粒體功能障礙可能與年齡相關疾病的發展有關。因此，通過SFN恢復Nrf2活性和內源性細胞保護機制可能是一種安全有效的策略，可以防止由于衰老而引起的肌肉和心臟功能障礙。
關鍵詞：心臟功能、線粒體功能障礙、Nrf2、氧化應激、肌肉減少癥、蘿卜硫素
1. 前言
衰老是受內在和外在因素共同調節的復雜生物過程。衰老的機制包括活性氧（ROS）、端?？s短和激素變化的作用。 年齡相關的線粒體功能障礙和氧化損傷是多種健康問題的主要原因，包括肌肉減少癥和心血管疾?。–VD）（Miller et al.，2012）。已經評估了幾種化學和功能不同的ROS和抗氧化劑產品的清除劑緩解年齡引起的肌肉丟失的能力（Barrera等人，2018），但收效甚微。它們缺乏益處的主要原因可能包括細胞系統中生物利用度低和/或對氧化劑和親電試劑的清除能力低。因此，促進內在抗氧化劑和細胞保護途徑的活性可能代表了一種對抗老年人肌肉功能喪失的更有效策略。
對于細胞適應氧化應激和親電子應激至關重要的酶（和其他蛋白質）的轉錄調控是由抗氧化劑反應性DNA元件（ARE）控制的，也稱為親電反應元件（Suh等人，2004）。細胞對親電應激反應的主要調節因子是轉錄因子Nrf2（核紅細胞-2-p45相關因子-2），被證明對解毒基因活性至關重要（Itoh等，2004），包括在哺乳動物的心臟細胞中以及心血管系統的其他組成部分（Dastani等，2012）。盡管Nrf2在肌病中的作用尚不明確，但其下調與肌肉減少癥和CVD相關（Gounder等，2012）。在生理條件下，Nrf2通過其阻遏因子，kelch樣ech結合蛋白1 (Keap1)結合在細胞質中。Keap1調節親電體對Nrf2的降解(Itoh等，2004)。親電物，包括天然化合物蘿卜硫素(SFN)，通過Keap1的硫醇修飾激活抗氧化和細胞保護途徑，使其在細胞質中與Nrf2分離。釋放后，Nrf2積聚在細胞核中，與小的Maf蛋白異源二聚體，并通過其AREs激活靶基因的轉錄（Cao等人，2006）。 Nrf2靶基因編碼參與細胞保護反應的蛋白質，包括細胞抗氧化劑和抗親電子活性以及重要的細胞抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的生物合成。迄今為止，親電代謝中編碼酶的所有已知基因以及眾多抗氧化酶均在基礎表達水平受到調控，并經常被Nrf2誘導（Dinkova-Kostova＆Abramov，2015）。
產生過量ROS的線粒體缺陷對細胞有害，并經常通過自噬/線粒體途徑清除，然后誘導線粒體生物發生，以試圖恢復線粒體的質量和功能（DinkovaKostova＆Abramov，2015）。Nrf2通過直接激活保護機制來維持氧化應激期間的線粒體形態和完整性（Dinkova-Kostova＆Abramov，2015）。
SFN是十字花科蔬菜中的一種植物化學物質，是一種無毒化合物，因其在不同疾病模型中的抗衰老、抗癌、抗糖尿病、抗微生物和化學預防活性而被公認（Kensler等，2013）。增強的Nrf2信號傳導和隨后的細胞保護性基因激活被認為是SFN作用的主要機制（Bai等人，2013）。SFN已顯示出減少小膠質細胞介導的神經炎癥的潛力，并可以減輕神經性行為缺陷并減輕阿爾茨海默氏病模型小鼠的αβ負擔（Uddin等，2020）。SFN改善肌肉功能，改善病理學，保護營養不良的肌肉并減輕肌肉發炎（Sun等，2015）。SFN還通過Akt/Foxo信號傳導抑制地塞米松誘導的肌管肌肉萎縮（Son等人，2017）。此外，SFN可以通過促進抗氧化劑機制修復與年齡有關的心血管疾病中的血管平滑肌細胞功能障礙，并防止皮膚衰老（Sedlak等人，2018）。目前，一些正在進行的臨床前和臨床試驗研究了其對癌癥、胰島素抵抗、精神分裂癥和自閉癥的作用（Kensler等，2013； K. Singh等，2014）。
因為已知SFN可以激活Nrf2并減輕氧化損傷，所以在這項研究中，我們研究了SFN處理是否可以恢復老年小鼠的Nrf2活性、線粒體功能以及骨骼肌和心臟功能。我們還評估了SFN處理和對照小鼠的骨骼肌和心臟中的轉錄組改變。在這項研究中，我們為上調Nrf2活性作為一種緩解年齡誘導的肌肉和心臟功能障礙的新治療策略奠定了基礎。
2. 結論
2.1 SFN提高生存率，但不影響動物體重
在21-22個月大時，將雄性C57BL / 6小鼠置于含有SFN的飲食或對照飲食（每組n = 20小鼠）中，共12周。在SFN給藥期間，對照組中有6只小鼠死亡。另一方面，SFN飲食組中的所有小鼠均存活到實驗結束，直到它們達到24至25個月大時為止（圖1a）。膳食補充SFN并不會影響年輕或成年小鼠的體重。正如預期的那樣，在兩個飲食組中，年輕小鼠的體重增長都快于老年小鼠（圖1b）。另一方面，補充SFN會影響進水量（圖1c）。與對照組飲食相比，SFN飲食喂養的年輕小鼠的飲水量顯著降低。在年長的動物群中也觀察到了同樣的情況。但是，食物攝入量不受影響（圖1d）。此外，補充SFN不會影響年輕和老年小鼠的血液學參數（表S1）。
2.2 SFN可以降低老年小鼠的空腹血糖并改善其葡萄糖耐量
在SFN飲食中，年輕小鼠的空腹血糖水平不高于年輕對照小鼠（圖1e）。另一方面，飼喂SFN日糧的老年小鼠與老年對照組小鼠（102±9 mg / dl）相比，葡萄糖水平顯著降低（平均±SD：77±16 mg / dl）。在兩個飲食組中，葡萄糖水平都在C57BL / 6小鼠的正常范圍內或以下（Surwit等，1988）。由于對照組和治療組動物的空腹血糖水平差異不大，因此進行了腹膜內葡萄糖耐量試驗。SFN處理不影響年輕動物對葡萄糖給藥的反應（圖1f）。但是，與對照組相比，在接受飲食控制的老年小鼠中，注射葡萄糖后血糖水平顯著增加。此外，SFN治療逆轉了這種血糖升高的情況，并改善了老年動物的葡萄糖耐量（圖1f）。
2.3 SFN可改善老年小鼠的運動能力
我們測試了SFN治療是否會改善肌肉力量和運動能力。為此，我們研究了接受對照或SFN飲食喂養的年輕和老年小鼠，進行了不隨意的體育鍛煉來測試其肌肉力量。首先，我們通過將它們固定在粗線上來測試它們的抓地力。用對照飲食喂養的年輕和老年小鼠能夠分別平均維持54±5和39±5 s。用SFN飲食的年輕和老年小鼠能夠保持更長的時間，分別為64±13和86±12 s（圖2a）。令人驚訝的是，喂SFN的老年小鼠比喂SFN的年輕小鼠能堅持更長的時間。此外，我們比較了對照組和SFN處理的年輕小鼠和老年小鼠的運動能力，方法是讓它們在電動，速度可控的模塊化跑步機系統上運行（Handschin等，2007）。與年輕的同齡小鼠相比，接受對照飲食的老年小鼠的運動能力較低（圖2b）。飼喂富含SFN的飲食可以顯著改善老年小鼠的運動能力。由SFN喂食的老年老鼠在跑步機上的表??現與年輕動物相似。
2.4 SFN增加了骨骼肌干細胞的數量及其功能
從下肢的EDL肌肉分離的肌纖維培養72小時。固定了衛星細胞衍生的成肌細胞，并對Pax7和MyoD進行了免疫染色，以此作為衛星細胞增殖和分化的指標（圖S1-S8）。大部分衛星細胞表達Pax7，甚至更多表達MyoD（圖2c）。Pax7在SKM干細胞中的表達不影響MyoD表達，并有助于SKM的生長和再生（Zammit等，2006）。 在SFN飲食的年輕和老年小鼠中，Pax7-（圖2c）和MyoD（圖2d）陽性衛星細胞子代的比例顯著高于其年齡匹配的對照組。SFN治療可能會增加新的衛星細胞形成，從而滿足肌肉穩態的常規需求，或者可能是偶發性的肥大或修復需求。
2.5 SFN減少了SKM老化，氧化和凋亡的標志
組織學顯示，使用SFN飲食2個月后，載玻片的橫截面積更多地被肌纖維占據（圖S9）。同樣，肌肉肌抑制素（SKM質量的負調節劑）的染色也較少（圖S10）。最后，我們發現有證據表明SFN可以降低8OHdG（一種氧化的標志物）（圖S11）和Tunel染色（一種凋亡的替代標志物）（圖S12）。
2.6 SFN治療老年小鼠也可改善心臟功能
已知心臟/呼吸功能下降會限制老年人的運動能力（Farkhooy et al。，2018）。心臟衰老是一個內在的過程，具有深刻的細胞和分子變化，可導致心臟功能受損（Vigorito＆Giallauria，2014）。我們檢查了SFN是否能恢復老年小鼠的心臟功能。與對照飲食的年輕小鼠相比，對照飲食的老小鼠射血分數（61.0±1.0％）、短軸縮短率（32.1±0.7％）和每搏輸出量（32.8±9.2 µl）均降低（圖3a-c）。另一方面，補充SFN可以改善老年小鼠的射血分數（76.0±1.4），短軸縮短率（44.2±1.3％）和每搏輸出量（51.6±11.3 µl）。盡管SFN還可以顯著增加年輕小鼠的這些參數，但對老年小鼠的射血分數和分數縮短的影響更大。補充SFN對年輕小鼠的心輸出量無明顯影響，而老年小鼠的心輸出量則有明顯改善（圖3d）。結果，SFN喂養的老年小鼠的心輸出量與年輕對照組的相似。我們得出的結論是，SFN喂養的老年小鼠對與年齡相關的心臟功能喪失具有抵抗力。
2.7 SFN保護衰老心臟中的線粒體超微結構
線粒體是高能量需求型心肌細胞的主要能源，占據其細胞體積的40％以上（約5,000個線粒體/心肌細胞）。心肌細胞功能嚴重依賴于這些細胞器的健康狀況（Strom等，2016）。此外，與年齡相關的線粒體功能障礙可能是由于氧化損傷導致線粒體超微結構的變化所致（Vays等，2014）。為了確定SFN是否能預防與年齡相關的心臟線粒體超微結構變化，我們使用透射電子顯微鏡比較了對照組和SFN喂養的老年小鼠心臟之間的線粒體形態。結果表明，SFN保護線粒體免于與年齡相關的嵴紊亂、部分嵴溶解和基質電子密度降低的影響(圖4a)。由于參與氧化磷酸化的酶位于線粒體內膜上，嵴的表面積和數量通常與細胞的代謝活性相關（Arismendi-Morillo，2011）。為了進一步驗證在用SFN處理的老年小鼠心臟中觀察到的電子轉運鏈（ETC）復合物活性的增加/保護，我們用針對復合物I（NDUFS3-a核DNA編碼亞基）和復合物III的蛋白質的抗體進行了免疫染色（CORE2-線粒體編碼的亞基）。與年齡匹配的未治療動物的心臟相比，SFN處理后衰老的心臟中的線粒體復合物I和III亞基蛋白表達增加（圖4b）。這些數據表明，SFN可能維持線粒體功能的一種機制是誘導線粒體蛋白表達。另外，在老年小鼠的心肌線粒體中發現的蛋白質表達下降可能是由于氧化損傷。左心室組織的免疫組織化學分析顯示，SFN喂養的老年小鼠具有較低水平的硝基酪氨酸蛋白加合物（氧化應激的標志物）（圖4c）。這些作用可能有助于增加老年小鼠心臟的自噬，并通過SFN減輕自噬，如LC3-II在老年小鼠中的出現及其在SFN治療后的消失所證明的（圖S13）。
2.8 SFN改善老年小鼠的線粒體功能
心臟組織的線粒體特別豐富，可以滿足其高代謝需求。線粒體呼吸復合物的破壞可導致氧化劑的產生，ATP耗竭和心肌細胞功能障礙。線粒體功能一直被認為在衰老過程中會下降，從而導致氧化應激增加（Hebert等，2015）。我們通過高分辨率呼??吸測定法測量了心臟和SKM組織的線粒體功能。與年輕的小鼠心臟相比，老年人的ETC活性低約30％，SFN保護ETC免受這種與年齡相關的氧通量下降（圖5a）。此外，在SFN喂養的動物中ETC復合物I，I + II和最大呼吸的活性增加，但這種增加僅在老年小鼠中才顯著。SFN喂養動物的SKM的線粒體中也發現了這種類似趨勢，但并未達到顯著水平（圖5b）。
2.9 SFN恢復老年小鼠心臟和SKM中的Nrf2活性
除了對線粒體的影響外，Nrf2功能與年齡相關的下降已有充分的文獻記載（Gounder等，2012），但尚不清楚SFN是否能在老年人群中恢復Nrf2的活性。最近，我們報道Nrf2活性隨SFN處理而增加，并且是保護心臟免受諸如阿霉素和電離輻射之類的氧化劑傷害的關鍵（Boerma等，2015； P。Singh等，2015）。因此，我們比較了Nrf2 ARE結合活性在年輕和老年小鼠的心臟和SKM中的作用。與年齡匹配的對照組相比，SFN喂養的年輕和老年小鼠的心臟和SKM的核提取物中Nrf2活性均上調（圖6）。
2.10心臟和骨骼肌的qRT-PCR結果進一步描述了SFN發揮作用的潛在機制
為了進一步闡明SFN介導的小鼠心臟和SKM功能衰老增強的機制，我們檢查了許多與氧化劑和親電子代謝相關的基因的表達。選定的基因參與抗氧化劑，抗親電子活性，哺乳動物的壽命以及谷胱甘肽的合成和損失（表1和2），所有這些基因均受Nrf2的調控（Hayes＆Dinkova-Kostova，2014）。我們檢查了過氧化氫酶，Sod1，Sod2，HO1，Pxdn，Gpx1，HO-1，Gsta4，Akr3，Akr7，Akr 8，Sirt1，Pgc1，Gclc，Gclm和Nrf2的心臟和SKM轉錄水平（全表見表1基因）。在對Gclc，Gclm，Gsta4，Nqo-1，Ho-1和Sod2啟動子區域進行的計算機或體外分析中，發現了Nrf2的共有ARE結合位點（Tonelli et al。，2018）。
與飼喂對照飲食的小鼠相比，SFN飲食喂養的年輕和老年小鼠心臟中的許多抗氧化劑和抗親電子基因的心臟轉錄水平顯著增加（表1）。新陳代謝的這種變化可以解釋為什么含有SFN的飲食具有心臟保護作用，并能增強運動能力。在對照組中，大多數檢查的基因以較低的水平表達。與SFN喂養的動物相比，老年對照動物產生的較低水平的抗氧化劑和抗電子防御機制可能有助于心臟的氧化損傷。在用SFN日糧喂養的動物中，某些轉錄本的水平，特別是Sod1，Sod2，Cat和Nrf2，在老小鼠的心臟中降低，并且在日糧中被SFN基本上恢復了。Akr3證明了老年小鼠心臟的增加，并且在飲食中通過SFN得以部分恢復。
表2給出了來自相同小鼠的SKM的類似實驗的結果。在這種情況下，這些基因中的更多基因在老年小鼠中被下調，并且在飲食中被SFN很大程度上恢復：Cat，Sod1，Gpx1，Gsta4和Nrf2。盡管Sod2，Pxdn，Gclc和Gclm不受衰老的影響，但在老年小鼠的飲食中，它們也被SFN上調?？傊?，這些結果表明Nrf2途徑是在SFN治療后在老年小鼠中誘導的，并增強了SKM中的保護機制，可能甚至超過心臟?？偠灾?，這些結果表明Nrf2途徑是在SFN處理后在年輕和老年小鼠中誘導的，并增強了保護機制。
3. 討論
SFN可以延長老年小鼠的壽命，降低其患糖尿病的可能性，并提高其運動能力。運動能力增加的部分原因當然是由于SKM功能增強，但某些原因可能是由于保留了心臟功能。此外，在研究期間比較了使用SFN或對照飲食的成年小鼠的存活曲線，顯示了顯著的保護作用，從采用SFN飲食的老年動物的死亡率中得出結論（對數秩（Mantel-Cox）檢驗，p <.0087； Gehan–Breslow–Wilcoxon檢驗，p <.0089）。
我們使用年輕和老年的C57BL / B6J小鼠進行了SFN飲食研究，因為該小鼠壽命相對較長，并且死因各異，但腫瘤發生率低（Treuting等，2008）。先前的研究表明，SFN治療會降低以高脂飲食或以高脂高蔗糖飲食喂養的肥胖小鼠為食的小鼠的體重增加和食物攝入，并改變其代謝參數（Shawky等人，2016; Shawky＆Segar， 2018）。使用更正常的飲食，我們發現SFN對體重或食物攝入量沒有影響，盡管我們確實發現用SFN喂養的老年小鼠的水攝入量減少了。我們推測增加的肌肉質量可能彌補了水攝入減少所引起的體重差異。小鼠對血液學參數無統計學顯著影響（表S1）。使用SFN飲食的老年小鼠的空腹血糖水平比老年對照動物的空腹血糖水平稍低，但仍保持在正常范圍內。如圖1f所示，IPGTT在年輕小鼠中是正常的，但是與SFN飲食中的老年小鼠相比，對照飲食中的老年小鼠中胰島素抵抗變得明顯。個別年齡較大的小鼠（對照組和SFN飲食）對胰島素的反應之間的差異表明，采用對照飲食的老年小鼠開始出現代謝綜合征和病理。這些結果表明，SFN飲食可能對這些老年小鼠的胰島素抵抗具有有益的作用。
目前的研究結果包括，在使用SFN飲食的老年小鼠中，跑步機的運動能力和對前肢握力的反應明顯改善。飼喂SFN日糧的老年小鼠的跑步機運動能力大約是飼喂對照飲食的小鼠的1.5倍。當比較前肢的握力時，用SFN喂養的老年小鼠掛在電線上的時間是使用對照飲食的老年小鼠的兩倍以上。用SFN喂養的老年小鼠的表現甚至比年輕的小鼠還要好。用SFN喂養的小鼠的EDL肌纖維中Pax7和MyoD陽性衛星細胞的子代增加，表明老年小鼠的肌肉再生得到改善?？傮w而言，我們已經證明SFN飲食干預可以改善老年小鼠的運動表現，抓地力和增加肌肉干細胞的形成，這表明SFN可能是減少衰老人群肌肉減少癥的一種新型治療方法。
SFN還對老年小鼠的心臟功能產生治療作用。我們的結果表明，SFN治療可顯著改善老年小鼠的心臟射血分數，縮短分數，中風量和心輸出量，使老年小鼠的靜息心功能達到年輕小鼠的水平。這些特定的小鼠似乎比大多數其他研究的小鼠品系更容易發生收縮功能障礙，這些品系主要患有舒張功能障礙（de Lucia等人，2019）。然而，有報道說衰老小鼠的左心室射血分數降低導致收縮功能障礙（Han等，2020； Quarles等，2020），并且我們以前已經證明SFN可以防止阿霉素誘導的氧化應激左心室射血分數和分數縮短的異常（Benes et al。，2013; Bose et al。，2018; Singh et al。，2015）。
這項研究有幾個重要的局限性。它僅在雄性小鼠中進行；因此，性別差異是未知的。此外，這項研究是在相對較小的樣本量下進行的，僅使用了兩個年齡組，并且持續時間相對較短（12周）。我們尚未完全描述SKM與心臟受SFN影響的機制的差異。最后，將結果轉換為人類是未知的，尤其是在心力衰竭方面。然而，很明顯，老年人的骨骼肌和心肌功能均下降，并且極大地降低了生活質量。在這種情況下，SFN可能是一種有希望的策略，可以減輕這些組織的衰老過程。
衰老心臟中ROS的產生增加可導致心肌細胞的壞死和凋亡以及成纖維細胞的增殖以及膠原蛋白的過量生成和纖維化的發展，以及線粒體的損??害；這些事件隨后導致心臟重塑和功能障礙（Dai等，2014）。不幸的是，心臟中的抗氧化劑和親電子保護性酶水平較低，使其特別容易受到自由基的損害（Singh等，2015）。年齡相關的線粒體功能障礙是衰老的重要部分。這些能量源能夠自我復制，但隨著年齡的增長，會通過各種機制（包括氧化/親電子應力的持續惡性循環）而失效。為了進一步確定SFN在衰老過程中在線粒體功能和形態中的作用，我們評估了線粒體的超微結構，關鍵的電子轉運鏈復合物蛋白表達以及小鼠心臟中氧化應激的標志物以及心臟和SKM中的線粒體呼吸復合物。氧化劑和親電子試劑的增加，導致衰老期間的Nrf2活性和Nrf2響應基因，修飾了參與能量代謝的幾種線粒體蛋白，并導致嵴的混亂。從我們對心臟和SKM活組織檢查的高分辨率呼吸測定研究中獲得的數據表明，衰老會損害復雜的I，I＆II和最大呼吸功能，但這種影響在心臟中更為明顯。由SFN喂養的年老小鼠的線粒體復雜活動的心臟已完全恢復，接近年輕對照組的水平。由于這些活動在老年動物的心臟活檢中嚴重降低，因此恢復具有重要意義。喂食老年動物SFN后，CORE-2和NDUFS3表達增加，線粒體嵴混亂、部分嵴溶解、電子透明基質以及硝基酪氨酸蛋白加合物的水平降低，說明也可能有助于改善線粒體功能以及通過Nrf2依賴性細胞防御激活的SFN保護作用。我們認為通過SFN藥理激活Nrf2可能會通過增強2相排毒和抗氧化酶活性并保留電子傳輸鏈（ETC）復雜功能來消除衰老過程中產生的過量ROS。由于在線粒體較少的SKM中，其對線粒體功能的影響不太明顯，因此SFN可能對SKM發揮其他額外作用。
細胞中的累積氧化損傷是細胞衰老和衰老的基本特征。與年齡相關的氧化應激會促進心肌纖維化，左心室硬化的進行性增加以及心臟功能障礙，并且可能是導致肌肉無力和肌肉減少癥的因素之一。與年齡相關的Nrf2功能障礙可降低抗氧化劑和抗親電子酶的活性以及線粒體功能，導致體內穩態失調，并損害細胞的修復和再生能力。我們以前已經在體外和體內證明了SFN保護和增強Nrf2信號傳導，通過激活細胞保護性基因以抵抗輻射和阿霉素引起的心臟毒性以及其他相關疾?。–happle等，2012）。我們最近證明，SFN增強了小鼠心臟中的Nrf2信號傳導和細胞保護性基因活性，從而保護免受氧化損傷（Singh等人，2015）。
在本研究中，我們研究了飲食中的SFN是否能激活兩個最重要的功能組織SKM和心臟中的Nrf2活性和響應基因。我們確定了喂食SFN或對照飲食的年輕和老年小鼠的SKM和心臟中活性核Nrf2的量。SKM和SFN日糧喂養的年輕和老年小鼠的心臟顯示ARE結合活性顯著增加，這與對照飲食中老年小鼠中觀察到的活性顯著降低相反。老年對照組小鼠中Nrf2活性的下降清楚地表明，SKM和心臟（已經表達了低水平的保護酶）無法保護自己免受氧化和親電攻擊并正常運行。因此，在這項研究中，我們首次證明了衰老的心臟和SKM中氧化應激的增加與Nrf2調節異常引起的保護性反應失敗有關，并且可以通過讓老年小鼠（21到22個月大的小鼠）服用SFN來減輕這一過程。
檢測了對照組和SFN飼料喂養小鼠心臟(A)和SKM(B)中負責表達抗氧化、抗親電性和谷胱甘肽合成途徑酶的基因轉錄水平。（A）在心臟中，過氧化氫酶、Sod1、Sod2和Nrf2與衰老小鼠的功能降低以及SFN的恢復表現出最佳的相關性。此外，Akr3在老年小鼠中增加，SFN減少了這種增加。Sod1和Sod2保護線粒體基質中的線粒體復合物和活性酶，并維持體內穩態和線粒體完整性（Piao等人，2010）。（B）在SKM中，可能的因素眾多：過氧化氫酶、Sod1、Gpx1、Gsta4和Nrf2。心臟和SKM中受影響的基因之間只有部分重疊并不奇怪，特別是考慮到衰老和SFN對SKM中線粒體的影響較小。過氧化氫酶和Sod1可能在線粒體水平上發揮某些作用，但也可以增加抗氧化劑和抗電子防御機制的水平，并有助于降低脂質過氧化產物和4-HNE的濃度，從而恢復老年小鼠SKM的功能。酶促清除超氧化物自由基的能力可能是抵抗肌肉中自由基損傷的主要保護性適應措施，因此可能是抵抗少肌癥發展或發作的主要保護措施，并且可能還涉及Gpx1和Gsta4。我們的發現表明，SKM和心臟中活性Nrf2的增加促進了表達抗氧化劑和抗親電子酶基因的轉錄激活，這些基因在衰老過程中可能起關鍵作用。因此，SFN可以通過Keap1 / Nrf2途徑的其他作用（例如自噬、谷胱甘肽生物合成和衰老及與衰老相關疾病中的線粒體生物發生）恢復多種細胞防御，從而有效預防心臟和SKM組織功能障礙。
總之，與年齡有關的肌病是一個內在過程，其細胞和分子發生了深刻變化，導致心臟和SKM功能受損。使用小鼠衰老模型，我們證明了SFN飲食可以恢復衰老小鼠的SKM和心臟功能。我們的研究未發現含SFN飲食對小鼠有任何不利影響。對衰老心臟中呼吸鏈復合物活性的保護，線粒體復合蛋白的增加以及SFN的氧化損傷降低表明SFN增強了線粒體的功能。對Gpx1和Gsta4激活通路的進一步分析值得關注，因為對相關機制的分析可能發現針對肌少癥的新療法。保護和增強Nrf2驅動的生物學功能可能是對抗老年人SKM喪失和心臟功能喪失的一種安全有效的策略。我們的發現提供了有關新型生物標志物和替代終點的機制理解和信息，可應用于臨床。
圖1. 蘿卜硫素（SFN）飲食對小鼠存活、體重、食物攝入、水分攝入、空腹血糖和葡萄糖耐量的影響。與對照組相比，每組補充SFN的老年小鼠的存活率均顯著提高（a）（p = .0087，n = 20）。在開始SFN或對照飲食后，每周對年輕和老年小鼠的體重（b）、水攝入量（d）和食物攝入量（e）進行稱重。所示數據代表平均值±SD（n = 10）。使用重復測量雙向ANOVA，然后進行Bonferroni檢驗或未配對的Student t檢驗（下圖），確定同一組SFN或對照飲食喂養的小鼠之間的統計學顯著性。與同一組相比，* p <.05且ns =不顯著。SFN還減少了空腹血糖，并改善了受葡萄糖攻擊的老年小鼠的葡萄糖耐量。 （c）在禁食8小時后，測量對照或SFN飲食的年輕和老年小鼠的空腹血糖水平。顯示了平均值±SD（n = 10）；通過t檢驗，對照組或SFN日糧喂養的老年小鼠之間的差異具有統計學意義* p <.05和** p <.01。（f）禁食或SFN飲食的年輕和老年小鼠禁食4 h，并腹腔注射葡萄糖（2 g / kg體重）。通過對每只小鼠在0-120分鐘之間的數值積分來計算血糖水平-時間曲線下的面積，并且顯示了該面積的平均值±SD（n ＝ 10）。年輕小鼠之間的差異無統計學意義，但使用SFN飲食的老年小鼠之間的差異明顯改善。
圖2. 蘿卜硫素（SFN）改善了老鼠的抓地力、運動表現和骨骼肌干細胞數量。（a）聯合前肢抓地力測試用于測量小鼠的肌肉強度。（b）適應后，使小鼠在跑步機上以10％的斜率跑步，以增加疲勞速度。補充SFN飲食能顯著改善（t檢驗的* p <.05和**** p <.0001）老年小鼠的運動能力和抓地力（n = 10）。將來自同一組的成批肌纖維共免疫Pax7（c）和MyoD（d）。數值代表來自平均年齡的T72肌纖維補充SFN或對照飲食的總體數據中的總體平均值。每個類別中衛星細胞的數量表示為肌纖維上存在的全部免疫染色細胞的平均百分比（通過t檢驗，雙向方差分析，*** p <.001）。
圖3. 蘿卜硫素（SFN）處理可保護小鼠免受年齡相關性心肌病的侵害。通過以下各項來評估心臟功能：（a）射血分數，（b）短軸縮短率，（c）每搏輸出量和（d）心輸出量，它們在補充了SFN飲食的老年小鼠中顯著保留。黑色柱代表以對照飲食喂養的小鼠，灰色柱代表以補充SFN飲食喂養的小鼠。統計顯著性*** p <.001和**** p <.0001由ANOVA和Tukey（n = 10）確定。
圖4蘿卜硫素（SFN）可增加ETC復雜蛋白的表達并保護衰老心臟中線粒體的超微結構。（a）SFN可以防止衰老心臟中的線粒體嵴紊亂、部分嵴溶解和基質電子密度降低（代表n = 3）。（b）NDUSF3和CORE-2的免疫組織化學檢測（棕色染色）顯示，SFN喂養的老小鼠左心室水平升高（代表n = 5）。（c）補充SFN可以逆轉衰老心臟因氧化應激引起蛋白質硝化作用（代表n = 5）
圖5. 蘿卜硫素（SFN）改善了衰老心臟的ETC功能。在接受i）對照飲食或ii）SFN喂養的年輕和老年小鼠（n = 10）的新鮮心臟（a）和SKM活檢組織（b）中，使用方法部分中所述的底物抑制劑滴定方法評估了復合物I，II + III的呼吸狀態以及ETC的最大呼吸。根據氧氣通量測量，與對照組飲食喂養的老年小鼠相比，SFN喂養的老年小鼠表現出改善的I，I + II和最大呼吸。每個條形表示平均值±SD（n = 10）； 通過非配對t檢驗評估統計學顯著性（通過t檢驗，ns> 0.05，** p <.01和*** p <.001）。
圖6. 補充蘿卜硫素（SFN）的飲食可改善Nrf2活性。SFN補充改善了老年小鼠心臟的Nrf2-ARE結合活性（n = 5）。統計學顯著性* p <.05，** p <.01和*** p <.001是通過ANOVA和隨后的Tukey多重比較檢驗確定的。
表1. 對照組年輕和老年小鼠以及飼喂SFN的小鼠心臟Nrf2和Nrf2靶基因轉錄的相對豐度。
表2. 對照組年輕和老年小鼠以及飼喂SFN小鼠骨骼肌Nrf2和Nrf2靶基因轉錄量的相對豐度。
年齡相關的線粒體功能障礙和氧化損傷是多種健康問題的主要原因，包括肌肉減少癥和心血管疾?。–VD）。盡管Nrf2（一種調節細胞保護性基因表達的轉錄因子）在肌肉病變中的作用仍不清楚，但它在肌肉減少癥和CVD中均顯示出有益的特性。蘿卜硫素（SFN）是一種激活Nrf2相關細胞保護基因的天然化合物，可對包括CVD在內的多種疾病提供保護，并且正在進行從預防癌癥到降低胰島素抵抗的各個階段臨床試驗。這項研究旨在確定SFN是否可以預防與年齡相關的心臟和骨骼肌功能喪失。對2個月大和21至22個月大的小鼠進行常規嚙齒動物飲食或補充SFN的飲食12周。在研究完成時，檢測了骨骼肌和心臟功能、線粒體功能和Nrf2活性。我們的研究表明，與年輕組小鼠相比，老年對照組小鼠的Nrf2活性和線粒體功能顯著下降，并且骨骼肌和心臟功能喪失。在老年小鼠中，SFN恢復了Nrf2活性、線粒體功能、心臟功能、運動能力、葡萄糖耐量以及骨骼肌衛星細胞的激活/分化。我們的結果表明，與年齡相關的Nrf2信號傳導活性下降和與之相關的線粒體功能障礙可能與年齡相關疾病的發展有關。因此，通過SFN恢復Nrf2活性和內源性細胞保護機制可能是一種安全有效的策略，可以防止由于衰老而引起的肌肉和心臟功能障礙。
關鍵詞：心臟功能、線粒體功能障礙、Nrf2、氧化應激、肌肉減少癥、蘿卜硫素
1. 前言
衰老是受內在和外在因素共同調節的復雜生物過程。衰老的機制包括活性氧（ROS）、端?？s短和激素變化的作用。 年齡相關的線粒體功能障礙和氧化損傷是多種健康問題的主要原因，包括肌肉減少癥和心血管疾?。–VD）（Miller et al.，2012）。已經評估了幾種化學和功能不同的ROS和抗氧化劑產品的清除劑緩解年齡引起的肌肉丟失的能力（Barrera等人，2018），但收效甚微。它們缺乏益處的主要原因可能包括細胞系統中生物利用度低和/或對氧化劑和親電試劑的清除能力低。因此，促進內在抗氧化劑和細胞保護途徑的活性可能代表了一種對抗老年人肌肉功能喪失的更有效策略。
對于細胞適應氧化應激和親電子應激至關重要的酶（和其他蛋白質）的轉錄調控是由抗氧化劑反應性DNA元件（ARE）控制的，也稱為親電反應元件（Suh等人，2004）。細胞對親電應激反應的主要調節因子是轉錄因子Nrf2（核紅細胞-2-p45相關因子-2），被證明對解毒基因活性至關重要（Itoh等，2004），包括在哺乳動物的心臟細胞中以及心血管系統的其他組成部分（Dastani等，2012）。盡管Nrf2在肌病中的作用尚不明確，但其下調與肌肉減少癥和CVD相關（Gounder等，2012）。在生理條件下，Nrf2通過其阻遏因子，kelch樣ech結合蛋白1 (Keap1)結合在細胞質中。Keap1調節親電體對Nrf2的降解(Itoh等，2004)。親電物，包括天然化合物蘿卜硫素(SFN)，通過Keap1的硫醇修飾激活抗氧化和細胞保護途徑，使其在細胞質中與Nrf2分離。釋放后，Nrf2積聚在細胞核中，與小的Maf蛋白異源二聚體，并通過其AREs激活靶基因的轉錄（Cao等人，2006）。 Nrf2靶基因編碼參與細胞保護反應的蛋白質，包括細胞抗氧化劑和抗親電子活性以及重要的細胞抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的生物合成。迄今為止，親電代謝中編碼酶的所有已知基因以及眾多抗氧化酶均在基礎表達水平受到調控，并經常被Nrf2誘導（Dinkova-Kostova＆Abramov，2015）。
產生過量ROS的線粒體缺陷對細胞有害，并經常通過自噬/線粒體途徑清除，然后誘導線粒體生物發生，以試圖恢復線粒體的質量和功能（DinkovaKostova＆Abramov，2015）。Nrf2通過直接激活保護機制來維持氧化應激期間的線粒體形態和完整性（Dinkova-Kostova＆Abramov，2015）。
SFN是十字花科蔬菜中的一種植物化學物質，是一種無毒化合物，因其在不同疾病模型中的抗衰老、抗癌、抗糖尿病、抗微生物和化學預防活性而被公認（Kensler等，2013）。增強的Nrf2信號傳導和隨后的細胞保護性基因激活被認為是SFN作用的主要機制（Bai等人，2013）。SFN已顯示出減少小膠質細胞介導的神經炎癥的潛力，并可以減輕神經性行為缺陷并減輕阿爾茨海默氏病模型小鼠的αβ負擔（Uddin等，2020）。SFN改善肌肉功能，改善病理學，保護營養不良的肌肉并減輕肌肉發炎（Sun等，2015）。SFN還通過Akt/Foxo信號傳導抑制地塞米松誘導的肌管肌肉萎縮（Son等人，2017）。此外，SFN可以通過促進抗氧化劑機制修復與年齡有關的心血管疾病中的血管平滑肌細胞功能障礙，并防止皮膚衰老（Sedlak等人，2018）。目前，一些正在進行的臨床前和臨床試驗研究了其對癌癥、胰島素抵抗、精神分裂癥和自閉癥的作用（Kensler等，2013； K. Singh等，2014）。
因為已知SFN可以激活Nrf2并減輕氧化損傷，所以在這項研究中，我們研究了SFN處理是否可以恢復老年小鼠的Nrf2活性、線粒體功能以及骨骼肌和心臟功能。我們還評估了SFN處理和對照小鼠的骨骼肌和心臟中的轉錄組改變。在這項研究中，我們為上調Nrf2活性作為一種緩解年齡誘導的肌肉和心臟功能障礙的新治療策略奠定了基礎。
2. 結論
2.1 SFN提高生存率，但不影響動物體重
在21-22個月大時，將雄性C57BL / 6小鼠置于含有SFN的飲食或對照飲食（每組n = 20小鼠）中，共12周。在SFN給藥期間，對照組中有6只小鼠死亡。另一方面，SFN飲食組中的所有小鼠均存活到實驗結束，直到它們達到24至25個月大時為止（圖1a）。膳食補充SFN并不會影響年輕或成年小鼠的體重。正如預期的那樣，在兩個飲食組中，年輕小鼠的體重增長都快于老年小鼠（圖1b）。另一方面，補充SFN會影響進水量（圖1c）。與對照組飲食相比，SFN飲食喂養的年輕小鼠的飲水量顯著降低。在年長的動物群中也觀察到了同樣的情況。但是，食物攝入量不受影響（圖1d）。此外，補充SFN不會影響年輕和老年小鼠的血液學參數（表S1）。
2.2 SFN可以降低老年小鼠的空腹血糖并改善其葡萄糖耐量
在SFN飲食中，年輕小鼠的空腹血糖水平不高于年輕對照小鼠（圖1e）。另一方面，飼喂SFN日糧的老年小鼠與老年對照組小鼠（102±9 mg / dl）相比，葡萄糖水平顯著降低（平均±SD：77±16 mg / dl）。在兩個飲食組中，葡萄糖水平都在C57BL / 6小鼠的正常范圍內或以下（Surwit等，1988）。由于對照組和治療組動物的空腹血糖水平差異不大，因此進行了腹膜內葡萄糖耐量試驗。SFN處理不影響年輕動物對葡萄糖給藥的反應（圖1f）。但是，與對照組相比，在接受飲食控制的老年小鼠中，注射葡萄糖后血糖水平顯著增加。此外，SFN治療逆轉了這種血糖升高的情況，并改善了老年動物的葡萄糖耐量（圖1f）。
2.3 SFN可改善老年小鼠的運動能力
我們測試了SFN治療是否會改善肌肉力量和運動能力。為此，我們研究了接受對照或SFN飲食喂養的年輕和老年小鼠，進行了不隨意的體育鍛煉來測試其肌肉力量。首先，我們通過將它們固定在粗線上來測試它們的抓地力。用對照飲食喂養的年輕和老年小鼠能夠分別平均維持54±5和39±5 s。用SFN飲食的年輕和老年小鼠能夠保持更長的時間，分別為64±13和86±12 s（圖2a）。令人驚訝的是，喂SFN的老年小鼠比喂SFN的年輕小鼠能堅持更長的時間。此外，我們比較了對照組和SFN處理的年輕小鼠和老年小鼠的運動能力，方法是讓它們在電動，速度可控的模塊化跑步機系統上運行（Handschin等，2007）。與年輕的同齡小鼠相比，接受對照飲食的老年小鼠的運動能力較低（圖2b）。飼喂富含SFN的飲食可以顯著改善老年小鼠的運動能力。由SFN喂食的老年老鼠在跑步機上的表??現與年輕動物相似。
2.4 SFN增加了骨骼肌干細胞的數量及其功能
從下肢的EDL肌肉分離的肌纖維培養72小時。固定了衛星細胞衍生的成肌細胞，并對Pax7和MyoD進行了免疫染色，以此作為衛星細胞增殖和分化的指標（圖S1-S8）。大部分衛星細胞表達Pax7，甚至更多表達MyoD（圖2c）。Pax7在SKM干細胞中的表達不影響MyoD表達，并有助于SKM的生長和再生（Zammit等，2006）。 在SFN飲食的年輕和老年小鼠中，Pax7-（圖2c）和MyoD（圖2d）陽性衛星細胞子代的比例顯著高于其年齡匹配的對照組。SFN治療可能會增加新的衛星細胞形成，從而滿足肌肉穩態的常規需求，或者可能是偶發性的肥大或修復需求。
2.5 SFN減少了SKM老化，氧化和凋亡的標志
組織學顯示，使用SFN飲食2個月后，載玻片的橫截面積更多地被肌纖維占據（圖S9）。同樣，肌肉肌抑制素（SKM質量的負調節劑）的染色也較少（圖S10）。最后，我們發現有證據表明SFN可以降低8OHdG（一種氧化的標志物）（圖S11）和Tunel染色（一種凋亡的替代標志物）（圖S12）。
2.6 SFN治療老年小鼠也可改善心臟功能
已知心臟/呼吸功能下降會限制老年人的運動能力（Farkhooy et al。，2018）。心臟衰老是一個內在的過程，具有深刻的細胞和分子變化，可導致心臟功能受損（Vigorito＆Giallauria，2014）。我們檢查了SFN是否能恢復老年小鼠的心臟功能。與對照飲食的年輕小鼠相比，對照飲食的老小鼠射血分數（61.0±1.0％）、短軸縮短率（32.1±0.7％）和每搏輸出量（32.8±9.2 µl）均降低（圖3a-c）。另一方面，補充SFN可以改善老年小鼠的射血分數（76.0±1.4），短軸縮短率（44.2±1.3％）和每搏輸出量（51.6±11.3 µl）。盡管SFN還可以顯著增加年輕小鼠的這些參數，但對老年小鼠的射血分數和分數縮短的影響更大。補充SFN對年輕小鼠的心輸出量無明顯影響，而老年小鼠的心輸出量則有明顯改善（圖3d）。結果，SFN喂養的老年小鼠的心輸出量與年輕對照組的相似。我們得出的結論是，SFN喂養的老年小鼠對與年齡相關的心臟功能喪失具有抵抗力。
2.7 SFN保護衰老心臟中的線粒體超微結構
線粒體是高能量需求型心肌細胞的主要能源，占據其細胞體積的40％以上（約5,000個線粒體/心肌細胞）。心肌細胞功能嚴重依賴于這些細胞器的健康狀況（Strom等，2016）。此外，與年齡相關的線粒體功能障礙可能是由于氧化損傷導致線粒體超微結構的變化所致（Vays等，2014）。為了確定SFN是否能預防與年齡相關的心臟線粒體超微結構變化，我們使用透射電子顯微鏡比較了對照組和SFN喂養的老年小鼠心臟之間的線粒體形態。結果表明，SFN保護線粒體免于與年齡相關的嵴紊亂、部分嵴溶解和基質電子密度降低的影響(圖4a)。由于參與氧化磷酸化的酶位于線粒體內膜上，嵴的表面積和數量通常與細胞的代謝活性相關（Arismendi-Morillo，2011）。為了進一步驗證在用SFN處理的老年小鼠心臟中觀察到的電子轉運鏈（ETC）復合物活性的增加/保護，我們用針對復合物I（NDUFS3-a核DNA編碼亞基）和復合物III的蛋白質的抗體進行了免疫染色（CORE2-線粒體編碼的亞基）。與年齡匹配的未治療動物的心臟相比，SFN處理后衰老的心臟中的線粒體復合物I和III亞基蛋白表達增加（圖4b）。這些數據表明，SFN可能維持線粒體功能的一種機制是誘導線粒體蛋白表達。另外，在老年小鼠的心肌線粒體中發現的蛋白質表達下降可能是由于氧化損傷。左心室組織的免疫組織化學分析顯示，SFN喂養的老年小鼠具有較低水平的硝基酪氨酸蛋白加合物（氧化應激的標志物）（圖4c）。這些作用可能有助于增加老年小鼠心臟的自噬，并通過SFN減輕自噬，如LC3-II在老年小鼠中的出現及其在SFN治療后的消失所證明的（圖S13）。
2.8 SFN改善老年小鼠的線粒體功能
心臟組織的線粒體特別豐富，可以滿足其高代謝需求。線粒體呼吸復合物的破壞可導致氧化劑的產生，ATP耗竭和心肌細胞功能障礙。線粒體功能一直被認為在衰老過程中會下降，從而導致氧化應激增加（Hebert等，2015）。我們通過高分辨率呼??吸測定法測量了心臟和SKM組織的線粒體功能。與年輕的小鼠心臟相比，老年人的ETC活性低約30％，SFN保護ETC免受這種與年齡相關的氧通量下降（圖5a）。此外，在SFN喂養的動物中ETC復合物I，I + II和最大呼吸的活性增加，但這種增加僅在老年小鼠中才顯著。SFN喂養動物的SKM的線粒體中也發現了這種類似趨勢，但并未達到顯著水平（圖5b）。
2.9 SFN恢復老年小鼠心臟和SKM中的Nrf2活性
除了對線粒體的影響外，Nrf2功能與年齡相關的下降已有充分的文獻記載（Gounder等，2012），但尚不清楚SFN是否能在老年人群中恢復Nrf2的活性。最近，我們報道Nrf2活性隨SFN處理而增加，并且是保護心臟免受諸如阿霉素和電離輻射之類的氧化劑傷害的關鍵（Boerma等，2015； P。Singh等，2015）。因此，我們比較了Nrf2 ARE結合活性在年輕和老年小鼠的心臟和SKM中的作用。與年齡匹配的對照組相比，SFN喂養的年輕和老年小鼠的心臟和SKM的核提取物中Nrf2活性均上調（圖6）。
2.10心臟和骨骼肌的qRT-PCR結果進一步描述了SFN發揮作用的潛在機制
為了進一步闡明SFN介導的小鼠心臟和SKM功能衰老增強的機制，我們檢查了許多與氧化劑和親電子代謝相關的基因的表達。選定的基因參與抗氧化劑，抗親電子活性，哺乳動物的壽命以及谷胱甘肽的合成和損失（表1和2），所有這些基因均受Nrf2的調控（Hayes＆Dinkova-Kostova，2014）。我們檢查了過氧化氫酶，Sod1，Sod2，HO1，Pxdn，Gpx1，HO-1，Gsta4，Akr3，Akr7，Akr 8，Sirt1，Pgc1，Gclc，Gclm和Nrf2的心臟和SKM轉錄水平（全表見表1基因）。在對Gclc，Gclm，Gsta4，Nqo-1，Ho-1和Sod2啟動子區域進行的計算機或體外分析中，發現了Nrf2的共有ARE結合位點（Tonelli et al。，2018）。
與飼喂對照飲食的小鼠相比，SFN飲食喂養的年輕和老年小鼠心臟中的許多抗氧化劑和抗親電子基因的心臟轉錄水平顯著增加（表1）。新陳代謝的這種變化可以解釋為什么含有SFN的飲食具有心臟保護作用，并能增強運動能力。在對照組中，大多數檢查的基因以較低的水平表達。與SFN喂養的動物相比，老年對照動物產生的較低水平的抗氧化劑和抗電子防御機制可能有助于心臟的氧化損傷。在用SFN日糧喂養的動物中，某些轉錄本的水平，特別是Sod1，Sod2，Cat和Nrf2，在老小鼠的心臟中降低，并且在日糧中被SFN基本上恢復了。Akr3證明了老年小鼠心臟的增加，并且在飲食中通過SFN得以部分恢復。
表2給出了來自相同小鼠的SKM的類似實驗的結果。在這種情況下，這些基因中的更多基因在老年小鼠中被下調，并且在飲食中被SFN很大程度上恢復：Cat，Sod1，Gpx1，Gsta4和Nrf2。盡管Sod2，Pxdn，Gclc和Gclm不受衰老的影響，但在老年小鼠的飲食中，它們也被SFN上調?？傊?，這些結果表明Nrf2途徑是在SFN治療后在老年小鼠中誘導的，并增強了SKM中的保護機制，可能甚至超過心臟?？偠灾?，這些結果表明Nrf2途徑是在SFN處理后在年輕和老年小鼠中誘導的，并增強了保護機制。
3. 討論
SFN可以延長老年小鼠的壽命，降低其患糖尿病的可能性，并提高其運動能力。運動能力增加的部分原因當然是由于SKM功能增強，但某些原因可能是由于保留了心臟功能。此外，在研究期間比較了使用SFN或對照飲食的成年小鼠的存活曲線，顯示了顯著的保護作用，從采用SFN飲食的老年動物的死亡率中得出結論（對數秩（Mantel-Cox）檢驗，p <.0087； Gehan–Breslow–Wilcoxon檢驗，p <.0089）。
我們使用年輕和老年的C57BL / B6J小鼠進行了SFN飲食研究，因為該小鼠壽命相對較長，并且死因各異，但腫瘤發生率低（Treuting等，2008）。先前的研究表明，SFN治療會降低以高脂飲食或以高脂高蔗糖飲食喂養的肥胖小鼠為食的小鼠的體重增加和食物攝入，并改變其代謝參數（Shawky等人，2016; Shawky＆Segar， 2018）。使用更正常的飲食，我們發現SFN對體重或食物攝入量沒有影響，盡管我們確實發現用SFN喂養的老年小鼠的水攝入量減少了。我們推測增加的肌肉質量可能彌補了水攝入減少所引起的體重差異。小鼠對血液學參數無統計學顯著影響（表S1）。使用SFN飲食的老年小鼠的空腹血糖水平比老年對照動物的空腹血糖水平稍低，但仍保持在正常范圍內。如圖1f所示，IPGTT在年輕小鼠中是正常的，但是與SFN飲食中的老年小鼠相比，對照飲食中的老年小鼠中胰島素抵抗變得明顯。個別年齡較大的小鼠（對照組和SFN飲食）對胰島素的反應之間的差異表明，采用對照飲食的老年小鼠開始出現代謝綜合征和病理。這些結果表明，SFN飲食可能對這些老年小鼠的胰島素抵抗具有有益的作用。
目前的研究結果包括，在使用SFN飲食的老年小鼠中，跑步機的運動能力和對前肢握力的反應明顯改善。飼喂SFN日糧的老年小鼠的跑步機運動能力大約是飼喂對照飲食的小鼠的1.5倍。當比較前肢的握力時，用SFN喂養的老年小鼠掛在電線上的時間是使用對照飲食的老年小鼠的兩倍以上。用SFN喂養的老年小鼠的表現甚至比年輕的小鼠還要好。用SFN喂養的小鼠的EDL肌纖維中Pax7和MyoD陽性衛星細胞的子代增加，表明老年小鼠的肌肉再生得到改善?？傮w而言，我們已經證明SFN飲食干預可以改善老年小鼠的運動表現，抓地力和增加肌肉干細胞的形成，這表明SFN可能是減少衰老人群肌肉減少癥的一種新型治療方法。
SFN還對老年小鼠的心臟功能產生治療作用。我們的結果表明，SFN治療可顯著改善老年小鼠的心臟射血分數，縮短分數，中風量和心輸出量，使老年小鼠的靜息心功能達到年輕小鼠的水平。這些特定的小鼠似乎比大多數其他研究的小鼠品系更容易發生收縮功能障礙，這些品系主要患有舒張功能障礙（de Lucia等人，2019）。然而，有報道說衰老小鼠的左心室射血分數降低導致收縮功能障礙（Han等，2020； Quarles等，2020），并且我們以前已經證明SFN可以防止阿霉素誘導的氧化應激左心室射血分數和分數縮短的異常（Benes et al。，2013; Bose et al。，2018; Singh et al。，2015）。
這項研究有幾個重要的局限性。它僅在雄性小鼠中進行；因此，性別差異是未知的。此外，這項研究是在相對較小的樣本量下進行的，僅使用了兩個年齡組，并且持續時間相對較短（12周）。我們尚未完全描述SKM與心臟受SFN影響的機制的差異。最后，將結果轉換為人類是未知的，尤其是在心力衰竭方面。然而，很明顯，老年人的骨骼肌和心肌功能均下降，并且極大地降低了生活質量。在這種情況下，SFN可能是一種有希望的策略，可以減輕這些組織的衰老過程。
衰老心臟中ROS的產生增加可導致心肌細胞的壞死和凋亡以及成纖維細胞的增殖以及膠原蛋白的過量生成和纖維化的發展，以及線粒體的損??害；這些事件隨后導致心臟重塑和功能障礙（Dai等，2014）。不幸的是，心臟中的抗氧化劑和親電子保護性酶水平較低，使其特別容易受到自由基的損害（Singh等，2015）。年齡相關的線粒體功能障礙是衰老的重要部分。這些能量源能夠自我復制，但隨著年齡的增長，會通過各種機制（包括氧化/親電子應力的持續惡性循環）而失效。為了進一步確定SFN在衰老過程中在線粒體功能和形態中的作用，我們評估了線粒體的超微結構，關鍵的電子轉運鏈復合物蛋白表達以及小鼠心臟中氧化應激的標志物以及心臟和SKM中的線粒體呼吸復合物。氧化劑和親電子試劑的增加，導致衰老期間的Nrf2活性和Nrf2響應基因，修飾了參與能量代謝的幾種線粒體蛋白，并導致嵴的混亂。從我們對心臟和SKM活組織檢查的高分辨率呼吸測定研究中獲得的數據表明，衰老會損害復雜的I，I＆II和最大呼吸功能，但這種影響在心臟中更為明顯。由SFN喂養的年老小鼠的線粒體復雜活動的心臟已完全恢復，接近年輕對照組的水平。由于這些活動在老年動物的心臟活檢中嚴重降低，因此恢復具有重要意義。喂食老年動物SFN后，CORE-2和NDUFS3表達增加，線粒體嵴混亂、部分嵴溶解、電子透明基質以及硝基酪氨酸蛋白加合物的水平降低，說明也可能有助于改善線粒體功能以及通過Nrf2依賴性細胞防御激活的SFN保護作用。我們認為通過SFN藥理激活Nrf2可能會通過增強2相排毒和抗氧化酶活性并保留電子傳輸鏈（ETC）復雜功能來消除衰老過程中產生的過量ROS。由于在線粒體較少的SKM中，其對線粒體功能的影響不太明顯，因此SFN可能對SKM發揮其他額外作用。
細胞中的累積氧化損傷是細胞衰老和衰老的基本特征。與年齡相關的氧化應激會促進心肌纖維化，左心室硬化的進行性增加以及心臟功能障礙，并且可能是導致肌肉無力和肌肉減少癥的因素之一。與年齡相關的Nrf2功能障礙可降低抗氧化劑和抗親電子酶的活性以及線粒體功能，導致體內穩態失調，并損害細胞的修復和再生能力。我們以前已經在體外和體內證明了SFN保護和增強Nrf2信號傳導，通過激活細胞保護性基因以抵抗輻射和阿霉素引起的心臟毒性以及其他相關疾?。–happle等，2012）。我們最近證明，SFN增強了小鼠心臟中的Nrf2信號傳導和細胞保護性基因活性，從而保護免受氧化損傷（Singh等人，2015）。
在本研究中，我們研究了飲食中的SFN是否能激活兩個最重要的功能組織SKM和心臟中的Nrf2活性和響應基因。我們確定了喂食SFN或對照飲食的年輕和老年小鼠的SKM和心臟中活性核Nrf2的量。SKM和SFN日糧喂養的年輕和老年小鼠的心臟顯示ARE結合活性顯著增加，這與對照飲食中老年小鼠中觀察到的活性顯著降低相反。老年對照組小鼠中Nrf2活性的下降清楚地表明，SKM和心臟（已經表達了低水平的保護酶）無法保護自己免受氧化和親電攻擊并正常運行。因此，在這項研究中，我們首次證明了衰老的心臟和SKM中氧化應激的增加與Nrf2調節異常引起的保護性反應失敗有關，并且可以通過讓老年小鼠（21到22個月大的小鼠）服用SFN來減輕這一過程。
檢測了對照組和SFN飼料喂養小鼠心臟(A)和SKM(B)中負責表達抗氧化、抗親電性和谷胱甘肽合成途徑酶的基因轉錄水平。（A）在心臟中，過氧化氫酶、Sod1、Sod2和Nrf2與衰老小鼠的功能降低以及SFN的恢復表現出最佳的相關性。此外，Akr3在老年小鼠中增加，SFN減少了這種增加。Sod1和Sod2保護線粒體基質中的線粒體復合物和活性酶，并維持體內穩態和線粒體完整性（Piao等人，2010）。（B）在SKM中，可能的因素眾多：過氧化氫酶、Sod1、Gpx1、Gsta4和Nrf2。心臟和SKM中受影響的基因之間只有部分重疊并不奇怪，特別是考慮到衰老和SFN對SKM中線粒體的影響較小。過氧化氫酶和Sod1可能在線粒體水平上發揮某些作用，但也可以增加抗氧化劑和抗電子防御機制的水平，并有助于降低脂質過氧化產物和4-HNE的濃度，從而恢復老年小鼠SKM的功能。酶促清除超氧化物自由基的能力可能是抵抗肌肉中自由基損傷的主要保護性適應措施，因此可能是抵抗少肌癥發展或發作的主要保護措施，并且可能還涉及Gpx1和Gsta4。我們的發現表明，SKM和心臟中活性Nrf2的增加促進了表達抗氧化劑和抗親電子酶基因的轉錄激活，這些基因在衰老過程中可能起關鍵作用。因此，SFN可以通過Keap1 / Nrf2途徑的其他作用（例如自噬、谷胱甘肽生物合成和衰老及與衰老相關疾病中的線粒體生物發生）恢復多種細胞防御，從而有效預防心臟和SKM組織功能障礙。
總之，與年齡有關的肌病是一個內在過程，其細胞和分子發生了深刻變化，導致心臟和SKM功能受損。使用小鼠衰老模型，我們證明了SFN飲食可以恢復衰老小鼠的SKM和心臟功能。我們的研究未發現含SFN飲食對小鼠有任何不利影響。對衰老心臟中呼吸鏈復合物活性的保護，線粒體復合蛋白的增加以及SFN的氧化損傷降低表明SFN增強了線粒體的功能。對Gpx1和Gsta4激活通路的進一步分析值得關注，因為對相關機制的分析可能發現針對肌少癥的新療法。保護和增強Nrf2驅動的生物學功能可能是對抗老年人SKM喪失和心臟功能喪失的一種安全有效的策略。我們的發現提供了有關新型生物標志物和替代終點的機制理解和信息，可應用于臨床。
圖1. 蘿卜硫素（SFN）飲食對小鼠存活、體重、食物攝入、水分攝入、空腹血糖和葡萄糖耐量的影響。與對照組相比，每組補充SFN的老年小鼠的存活率均顯著提高（a）（p = .0087，n = 20）。在開始SFN或對照飲食后，每周對年輕和老年小鼠的體重（b）、水攝入量（d）和食物攝入量（e）進行稱重。所示數據代表平均值±SD（n = 10）。使用重復測量雙向ANOVA，然后進行Bonferroni檢驗或未配對的Student t檢驗（下圖），確定同一組SFN或對照飲食喂養的小鼠之間的統計學顯著性。與同一組相比，* p <.05且ns =不顯著。SFN還減少了空腹血糖，并改善了受葡萄糖攻擊的老年小鼠的葡萄糖耐量。 （c）在禁食8小時后，測量對照或SFN飲食的年輕和老年小鼠的空腹血糖水平。顯示了平均值±SD（n = 10）；通過t檢驗，對照組或SFN日糧喂養的老年小鼠之間的差異具有統計學意義* p <.05和** p <.01。（f）禁食或SFN飲食的年輕和老年小鼠禁食4 h，并腹腔注射葡萄糖（2 g / kg體重）。通過對每只小鼠在0-120分鐘之間的數值積分來計算血糖水平-時間曲線下的面積，并且顯示了該面積的平均值±SD（n ＝ 10）。年輕小鼠之間的差異無統計學意義，但使用SFN飲食的老年小鼠之間的差異明顯改善。
圖2. 蘿卜硫素（SFN）改善了老鼠的抓地力、運動表現和骨骼肌干細胞數量。（a）聯合前肢抓地力測試用于測量小鼠的肌肉強度。（b）適應后，使小鼠在跑步機上以10％的斜率跑步，以增加疲勞速度。補充SFN飲食能顯著改善（t檢驗的* p <.05和**** p <.0001）老年小鼠的運動能力和抓地力（n = 10）。將來自同一組的成批肌纖維共免疫Pax7（c）和MyoD（d）。數值代表來自平均年齡的T72肌纖維補充SFN或對照飲食的總體數據中的總體平均值。每個類別中衛星細胞的數量表示為肌纖維上存在的全部免疫染色細胞的平均百分比（通過t檢驗，雙向方差分析，*** p <.001）。
圖3. 蘿卜硫素（SFN）處理可保護小鼠免受年齡相關性心肌病的侵害。通過以下各項來評估心臟功能：（a）射血分數，（b）短軸縮短率，（c）每搏輸出量和（d）心輸出量，它們在補充了SFN飲食的老年小鼠中顯著保留。黑色柱代表以對照飲食喂養的小鼠，灰色柱代表以補充SFN飲食喂養的小鼠。統計顯著性*** p <.001和**** p <.0001由ANOVA和Tukey（n = 10）確定。
圖4蘿卜硫素（SFN）可增加ETC復雜蛋白的表達并保護衰老心臟中線粒體的超微結構。（a）SFN可以防止衰老心臟中的線粒體嵴紊亂、部分嵴溶解和基質電子密度降低（代表n = 3）。（b）NDUSF3和CORE-2的免疫組織化學檢測（棕色染色）顯示，SFN喂養的老小鼠左心室水平升高（代表n = 5）。（c）補充SFN可以逆轉衰老心臟因氧化應激引起蛋白質硝化作用（代表n = 5）
圖5. 蘿卜硫素（SFN）改善了衰老心臟的ETC功能。在接受i）對照飲食或ii）SFN喂養的年輕和老年小鼠（n = 10）的新鮮心臟（a）和SKM活檢組織（b）中，使用方法部分中所述的底物抑制劑滴定方法評估了復合物I，II + III的呼吸狀態以及ETC的最大呼吸。根據氧氣通量測量，與對照組飲食喂養的老年小鼠相比，SFN喂養的老年小鼠表現出改善的I，I + II和最大呼吸。每個條形表示平均值±SD（n = 10）； 通過非配對t檢驗評估統計學顯著性（通過t檢驗，ns> 0.05，** p <.01和*** p <.001）。
圖6. 補充蘿卜硫素（SFN）的飲食可改善Nrf2活性。SFN補充改善了老年小鼠心臟的Nrf2-ARE結合活性（n = 5）。統計學顯著性* p <.05，** p <.01和*** p <.001是通過ANOVA和隨后的Tukey多重比較檢驗確定的。
表1. 對照組年輕和老年小鼠以及飼喂SFN的小鼠心臟Nrf2和Nrf2靶基因轉錄的相對豐度。
表2. 對照組年輕和老年小鼠以及飼喂SFN小鼠骨骼肌Nrf2和Nrf2靶基因轉錄量的相對豐度。
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