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蘿卜硫素與吡哆胺的補充使2型糖尿病中的內皮功能紊亂恢復正常
發表于：2019-05-13 作者：admin 來源：本站 點擊量：5490
摘要
在本研究中，我們把吡哆胺（PM）和/或蘿卜硫素（SFN）作為治療干預措施，用于確定NFE2相關因子2（Nrf2）的激動劑是否可以同晚期糖基化終產物（AGE）形成抑制劑一起使用，達到減輕2型糖尿病患者的氧化應激和改善其內皮功能障礙。Goto Kakizaki（GK）大鼠，一種非肥胖型2型糖尿病動物模型，在8周內接受或不接受PM和/或SFN治療，并與年齡匹配的Wistar大鼠進行比較。在治療結束時，評估孤立主動脈和腸系膜動脈中一氧化氮（NO）依賴性和非依賴性的血管舒張。還評估了代謝概況、NO生物利用度和血管氧化應激、AGE和Nrf2水平。糖尿病GK大鼠的Nrf2水平顯著降低，同時氧化應激和內皮功能障礙水平也較高。PM和SFN作為單一療法能夠顯著改善主動脈和腸系膜動脈的內皮功能障礙，降低血管氧化損傷、AGE和HbA1c水平。此外，在GK大鼠中已證明，SFN+PM能更有效地降低全身游離脂肪酸水平，使內皮功能、NO生物利用度和糖化作用正?；?。Nrf2激動劑可與AGE抑制劑和交聯形成抑制劑聯用來治療2型糖尿病內皮功能障礙。
2型糖尿病與氧化應激水平升高和糖基化改變血管功能有關，因此被認為是心血管疾病發展的主要危險因素。許多的糖尿病并發癥都與高血糖和活性氧物種（ROS）生成增加有關，其導致了內皮功能紊亂。對血管舒張劑（如乙酰膽堿）的內皮依賴性舒張功能受損是1型和2型糖尿病實驗模型中導管和阻力動脈的共同特征。我們先前發現糖尿病GK大鼠的氧化應激和糖基化增加，而這種變化導向內皮功能障礙。
糖尿病的治療進展并不能有效地減少糖尿病相關的血管并發癥?？紤]到ROS在內皮功能中的關鍵作用，人們已經作出了相當大的努力來探索降低血管系統中ROS的治療方法。核因子E2（紅系衍生2）相關因子-2（Nrf2）是一種轉錄因子，在細胞對氧化應激的保護中起著關鍵作用。Nrf2被稱為抗氧化劑反應的“主調節器”。通過Nrf2/抗氧化反應元件途徑激動劑誘導內源性抗氧化酶可能是獲得足夠水平的抗氧化劑和減少氧化應激的一種有趣方法。膳食中的NRF2激動劑，如十字花科蔬菜中發現的異硫氰酸鹽蘿卜硫素（SFN），可以增加抗氧化防御，降低血壓，抑制腎臟內促炎信號通路，并預防高血糖引起的內皮細胞代謝紊亂。在糖尿病模型中，Nrf2的激活降低了野生型小鼠的血糖水平，減少了糖尿病相關腎病，但在Nrf2缺乏的小鼠中則沒有。因此，Nrf2誘導劑在血管疾病中的治療潛力巨大，特別是與長期2型糖尿病有關的血管疾病。
表1 8個月大的非糖尿病Wistar大鼠（W）、糖尿病Goto-Kakizaki大鼠（GK）、接受蘿卜硫素處理的GK大鼠（GKS）、接受吡哆胺處理的GK大鼠（GKP）和接受蘿卜硫素與吡哆胺處理的GK大鼠（GKSP）的體重和血脂水平。數據表示為平均值±SE（n=12每組動物）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs W大鼠。與GK大鼠相比，φφφP<0.001。§P<0.05 vs GKS大鼠。#P<0.05 vs GKP大鼠。
此外，在糖尿病情況下的晚期糖基化加速導致血管并發癥。幾位作者已經證明，抑制晚期糖基化終產物（AGE）形成可能是改善糖尿病血管并發癥的一種治療策略。吡哆胺（PM）是維生素B6的一種天然衍生物，已被證明是一種有效的蛋白質糖化和脂質氧化抑制劑。在體外和體內，PM均能抑制AGE的形成，對糖尿病腎病和視網膜病變的治療具有潛在的益處。
蘿卜硫素和吡哆胺有不同的作用機制。因此，我們假設單獨或聯合使用SFN、PM對2型糖尿病模型Goto-Kakizaki（GK）大鼠的內皮依賴性血管反應性、氧化應激和代謝參數具有有益影響。在糖尿病進展的同時，對脂質分布、氧化應激、糖基化和一氧化氮（NO）生物利用度進行了評價。此外，還評估了主動脈和腸系膜動脈對乙酰膽堿（ACH）和硝普鈉（SNP）的內皮依賴性和非依賴性血管敏感性。與Wistar大鼠相比，8個月大的GK大鼠表現出長期糖尿病表型，導管和阻力動脈內皮功能障礙，以及氧化應激增加。單用SFN和PM可以改善孤立動脈中的NO依賴性血管舒張。順帶一提，SFN和PM通過一種機制使主動脈和腸系膜動脈的內皮功能正?；?，該機制包括NO生物利用度的增加，以及氧化應激和AGE水平的降低?？傊?，這些研究表明，針對引起內皮功能障礙的不同機制，抑制AGE形成（PM）和促進抗氧化防御系統（SFN）增強應是對抗糖尿病大血管并發癥的有用工具，因其同時作用于最終導致血管損傷的不同機制。
結論
動物特征。我們實驗中使用的糖尿病大鼠在研究開始時表現出類似的空腹血糖水平。治療前的GK大鼠血糖（GK6M）明顯高于年齡匹配的非糖尿病大鼠（圖1補充）。GK大鼠的體重明顯低于年齡匹配的Wistar大鼠，不同的治療方法并沒有顯著改變這個參數（表1）。在腹膜內葡萄糖耐量試驗（IPGTT）中，GK大鼠與Wistar大鼠相比表現出明顯的葡萄糖不耐（圖1A）。與Wistar大鼠相比，GK大鼠的空腹血糖、葡萄糖曲線下面積（AUC）、HbA1c、總膽固醇和游離脂肪酸（FFA）升高（圖1B、C、D、表1）。如前所述，GK大鼠表現出正常的非HDL膽固醇和甘油三酯水平（表1）。單用SFN或PM治療并沒有顯著改變糖耐量和脂質分布評估（圖1A、C，表1）。同時，PM顯著降低了空腹血糖和HbA1c水平（圖1B、D）。事實上，所有的治療方法都能有效降低GK大鼠的HbA1c水平（圖1D）。此外，使用SFN和PM治療8周可有效降低糖尿病大鼠的血液中FFA濃度（表1），并顯著改善葡萄糖耐受性（圖1A、C）。
NO依賴性血管舒張。8個月大的GK大鼠與年齡匹配的Wistar大鼠相比，苯腎上腺素預收縮后的主動脈環響應乙酰膽堿（ACh）引起的內皮介導血管舒張能力受損（圖2A），但對硝普鈉（SNP）引起的非內皮依賴性舒張在這兩個物種中相似（圖3A）。事實上，在糖尿病大鼠中，苯腎上腺素預收縮主動脈環對乙酰膽堿引起的內皮介導血管最大舒張值降低了49%（圖2A）。在GK大鼠和Wistar大鼠中，用NOS抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和環氧合酶抑制劑吲哚美辛預孵化后的動脈環幾乎完全消除了Ach的松弛作用（圖2補充）。在我們的實驗條件下，其他血管擴張劑的殘余成分約為15%。在主動脈中，沒有觀察到不同組間SNP量效曲線在最大舒張值上的差異（圖3A）。所有GK治療組的最大舒張值顯著改善，對Ach的血管反應性有所改善（圖2A，表2）。用SFN、PM或SFN+PM治療可顯著改善糖尿病大鼠主動脈內皮依賴性血管舒張（圖2A，表2）。這種血管舒張對吲哚美辛不敏感，并被L-NAME阻斷，表明其機制依賴于內源性NO釋放（圖2補充）。此外，在所有GK治療組中觀察到SNP敏感性增加（圖3A，表2）。在腸系膜動脈中，糖尿病大鼠的苯腎上腺素預收縮后動脈環響應Ach引起的內皮介導的最大舒張值降低了36%（圖2B）。此外，糖尿病大鼠響應SNP引起的最大舒張值下降了39%（圖3B）。用SFN、PM或SFN+PM治療能夠改善內皮依賴性血管擴張（圖2B，表3）。類似地，這種作用對吲哚美辛不敏感，并被L-NAME抑制（圖2補充）。表2和表3總結了最大舒張值和EC50值的詳細數據。這些結果表明，單用SFN或PM治療可改善糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈的內皮依賴性血管舒張。與此相關，這些療法能夠使內皮介導的舒張正?；?，并提高主動脈和腸系膜動脈的SNP敏感性（圖2、3）。
圖1 與非糖尿病Wistar（W）大鼠相比，8個月大的糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠蘿卜硫素和吡哆胺處理的效果，腹腔葡萄糖耐量試驗（IPGTT；A）、空腹血糖（B）、葡萄糖曲線下面積（AUC；C）和糖化血紅蛋白（HbA1c）水平（D）。C）計算IPGTT曲線的AUC，以測量葡萄糖耐量受損的程度。數據表示為平均值±SE（n=12）。***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
血管壁的氧化應激。我們確定了SFN、PM或兩者對糖尿病血管系統氧化應激的潛在影響。有趣的是，糖尿病導致糖尿病大動脈中的超氧化物生成量增加了3倍（p<0.001；圖4B，K）。與GK大鼠相比，用SFN、PM和SFN+PM治療的糖尿病大鼠主動脈中二氫乙啶（DHE，ROS熒光探針）的密度顯著降低（圖4C、D、E、K）。此外，糖尿病GK大鼠腸系膜動脈中的免疫反應性硝基酪氨酸（蛋白質氧化生物標志物）水平也升高（p<0.001；圖4G，L），并且用SFN、PM或兩者治療后，這些水平顯著降低（圖4H，I，J，L）。因此，所有療法都能顯著降低糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈的血管氧化損傷。相應地，GK大鼠尿中8-羥基-2’-脫氧鳥苷（8-OHdG，DNA氧化損傷生物標志物）的水平明顯高于年齡匹配的Wistar大鼠（圖4M）。對GK大鼠使用SFN、PM或兩者治療8周后，8-OHdG水平顯著降低（圖4M）。
主動脈中的肺血管緊張素和總血管緊張素。血管舒張劑激活磷蛋白（VASP）在Ser239的磷酸化被證明是生物活性NO和NO-cGMP蛋白激酶G信號通路活性的指標。為了確定NO生物利用度，我們測量了主動脈中磷酸化血管舒張劑激活磷蛋白（pVASP）和總VASP。GK大鼠的主動脈pVASP/tVASP比率明顯低于Wistar大鼠（圖5A，B）。在糖尿病GK大鼠（GKS，GKP；GKSP；圖5A，B）中，用SFN、PM或兩者治療可顯著提高pVASP/TVSP比率。在腸系膜動脈中觀察到類似的情況（數據未列出）。
圖2 與非糖尿病Wistar大鼠（W）相比，蘿卜硫素和吡哆胺處理對GK大鼠主動脈（A）和腸系膜動脈（B）乙酰膽堿舒張反應的影響。數據表示為平均值±SE（n=12）。*P<0.05，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組；§P<0.05 vs GKS組；#P<0.05 vs GKP組。
圖3 與非糖尿病Wistar大鼠（W）相比，蘿卜硫素和吡哆胺處理對GK大鼠主動脈（A）和腸系膜動脈（B）中硝普鈉舒張反應的影響。數據表示為平均值±SE（n=12）。*P<0.05，****P<0.001 vs Wistar組；φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
表2 8個月大的不同處理的自發性糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠和年齡匹配的非糖尿病Wistar大鼠離體主動脈的最大舒張反應（%）和−logEC50。數據表示為平均值±SE（n=12每組動物）。 pEC50值以激動劑濃度的負對數（−logEC50）表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs W大鼠。與GK大鼠相比，φφP<0.01，φφφP<0.001。§P<0.05 vs GKS。 #P<0.05 vs GKP。
表3 8個月大的自發性糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠和匹配的非糖尿病Wistar大鼠腸系膜動脈的最大松弛反應（%）和−logEC50。數據表示為平均值±SE（n=12每組動物）。pEC50值以激動劑濃度的負對數（−logEC50）表示。***P<0.001 vs W大鼠。與GK大鼠相比，φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.01。§P<0.05 vs GKS。#P<0.05 vs GKP。
主動脈和腸系膜動脈中的Nrf2水平。我們隨后量化了不同組大鼠動脈中的Nrf2水平。用Western blot檢測主動脈中的Nrf2水平，以共聚焦顯微鏡觀察腸系膜動脈中的免疫熒光檢來測Nrf2水平。糖尿病大鼠血管中的Nrf2水平明顯低于主動脈和腸系膜動脈中年齡匹配的Wistar大鼠（圖6I，F）。蘿卜硫素治療組（GKS和GKSP）顯著增加了主動脈和腸系膜動脈中的細胞核Nrf2水平（圖6J，G）。Nrf2激動劑SFN增加糖尿病GK大鼠Nrf2的核定位，這可能導致抗氧化防御增加，促進血管氧化應激的減少。在糖尿病GK大鼠的主動脈和腸系膜動脈中，SFN顯著增加了Nrf2的表達（圖6），這表明它同時促進了表達增加和核易位，與其在其他組織中的作用相一致。
主動脈和腸系膜動脈的AGE水平。接下來，我們量化了不同組大鼠動脈中的AGE水平。主動脈和腸系膜動脈的AGE水平用共聚焦顯微鏡測量。糖尿病大鼠主動脈和腸系膜動脈中的AGE水平明顯高于年齡匹配的Wistar大鼠（分別為圖7B、K、G、L）。GK治療組（GKS、GKP和GKSP）主動脈和腸系膜動脈的血管AGE水平顯著降低（圖7K，L）。值得注意的是，PM治療組（GKP，GKSP）血管壁具有正常的AGE水平。
討論
在目前的研究中，蘿卜硫素、吡哆胺及其聯用對GK大鼠的糖尿病內皮功能障礙表現出明顯的治療潛力。用SFN、PM或兩者聯合治療GK大鼠可顯著降低主動脈和腸系膜動脈的內皮功能障礙。在這些血管中，SFN、PM或SFN+PM治療可延緩包括氧化損傷在內的糖尿病內皮功能障礙病理特征的出現。此外，這兩種相關療法都能降低FFA水平，也增加了NO生物利用度，這可以部分解釋2型糖尿病長期模型中內皮功能的正?；?。
GK大鼠為非肥胖2型糖尿病動物模型，具有輕度高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗。長期糖尿病通常與這些動物的胰腺功能喪失有關，其特征也類似于人類疾病進展中的相關特征。該模型與人類2型糖尿病共有包括異常血管反應性在內的多種心血管表型，證明其作為研究糖尿病并發癥的模型是合適的。
在此，我們發現8個月大的GK大鼠具有高血糖，顯著增加的總膽固醇和循環FFA水平的特征。內皮功能障礙在腸系膜動脈和主動脈動脈中都很明顯，其伴隨著氧化應激和糖基化作用升高、NO生物利用度下降和Nrf2水平降低。
Nrf2抗氧化功能在血管疾病中可能很重要。SFN是一種在西蘭花中發現的Nrf2激動劑，增加抗氧化反應元件相關轉錄控制下的保護酶的表達，并防止由高血糖引起的內皮細胞代謝功能障礙。在其它研究的基礎上，結合西蘭花芽苗中SFN的生物利用度，測定了該化合物的濃度。我們估計，在人體飲食可行的生理劑量下，SFN對治療內皮功能障礙具有潛在的治療益處。另一方面，我們最近檢查了2型糖尿病動物模型的AGE水平，發現血漿和血管壁的AGE水平都在增加。如PM的化合物可以降低高水平的AGE，和這種方法對內皮功能有潛在的有益作用。這兩種療法對大血管疾病的治療效果尚未被研究過。在本文中，我們研究了在血管水平上，有或沒有與PM共同抑制年齡形成的SFN的作用。
圖4 與非糖尿病Wistar（W）大鼠相比，蘿卜硫素和吡哆胺處理對GK大鼠全身和血管氧化應激的影響。代表性的DHE染色的主動脈段反映了不同處理（A-E）下的氧氣生成。所有的內皮都朝上。在相同的條件下，糖尿病患者GK（B）的熒光明顯高于正常血管（Wistar，A）。注意到GK主動脈內皮、內膜和介質中反射O2·−水平的熒光增強。糖尿病GK大鼠服用SFN（GKS，C）、PM（GKP，D）和SFN+PM（GKSP，E）后，DHE熒光降低。面板（K）包含不同動脈組中熒光溴化乙錠信號的量化。具有代表性的腸系膜切片用硝基酪氨酸染色顯示非糖尿病Wistar大鼠（F），糖尿病GK大鼠（G），糖尿病GK大鼠SFN（GKS，H）、PM（GKP，I）和SFN+PM（GKSP，J）處理組。面板（L）包含不同動脈組中綠色熒光的量化。（M）不同組大鼠尿8-羥基脫氧鳥苷（8-OHDG）水平。數據表示為平均值±SE（n＝12）。*P<0.05，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
單用SFN或PM治療8周并沒有顯著改善甘油三酯、膽固醇和FFA水平。已經證明，PM可以糾正糖尿病和肥胖大鼠的高脂血癥和腎病，可能是通過干擾各種AGE/晚期脂質氧化最終產物（ALE，由脂質氧化形成）的活性羰基中間產物。在不同的動物模型中，更高濃度的PM（400 mg/kg/天）具有這種降脂作用。此外，Nrf2通路具有調節肝臟脂質代謝的功能。Nrf2負性調節許多編碼參與脂質生物合成、脂肪酸去飽和與脂肪酸轉運的酶的基因。相反，0.5 mg/kg的SFN會損害鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠的肝功能并加重的膽固醇水平。此外，在我們的實驗條件下，單用SFN治療不會改變脂質分布。
SFN+PM治療對總膽固醇和甘油三酯水平沒有影響，但卻顯著降低了FFA和HbA1c水平。兩種聯合治療均能改善葡萄糖耐受性，顯著減少葡萄糖曲線下面積。靶向糖基化和抗氧化防御系統的PM和SFN在降低FFA和HbA1c水平方面非常有效。重要的是，SFN和PM治療對胰島素水平沒有影響，這解釋了在治療糖尿病大鼠中觀察到的高血糖。事實上，在所有GK治療組中，血糖水平明顯高于Wistar大鼠。然而，在這些條件下，sfn+pm的血管保護作用是明顯的，表明正常血糖的完全恢復不是血管保護的先決條件。
其他研究者先前報道，在非缺陷Nrf2的野生型小鼠中，Nrf2的激活降低了血糖水平，減少了糖尿病相關腎病。而這項研究中，SFN治療組（GKS）沒有促進血糖水平下降。不同的動物模型和實驗條件可以解釋這些差異。
圖5 蘿卜硫素和吡哆胺處理對pVASP和tVASP表達水平的影響。為了檢測NO-cGMP信號激活，評估主動脈中總血管舒張劑刺激的磷酸蛋白（tVASP）和磷酸化（ser239）VASP（pVASP）的表達。用SDS-PAGE法測定主動脈裂解物。（A）不同動脈組的主動脈中總血管緊張素（VASP）和pVASP蛋白水平的典型Western blot條帶。（B）pVASP/總VASP比的平均密度測定數據。數據表示為平均值±SE（n=12）。***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφφP<0.001 vs GK組。
氧化應激在內皮功能障礙發病機制中的作用已被充分確證。糖尿病增加血管系統中的活性氧，損害抗氧化防御酶，并降低細胞內抗氧化物的水平，創造一個氧化應激增加的環境。在血管模型中，Nrf2通路激動劑通過增加抗氧化/親電反應元件介導的II相酶和抗氧化酶表達（包括NAD（P）H:醌氧化還原酶-1、血紅素氧合酶-1和γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞單位）來恢復氧化還原平衡。在這項研究中，我們提出的證據表明，SFN和PM治療在體內具有抗氧化作用：在糖尿病GK大鼠中，SFN、PM或SFN+PM降低了尿8-OHdG和組織中O2•−陰離子以及硝基酪氨酸的積累量。這種抗氧化作用是已觀察到的內皮功能障礙正?；瘷C制的重要因素。因此，其他研究也報道了不同條件下SFN對氧化應激的抑制作用。在糖尿病db/db微血管系統中，用SFN靶向Nrf2通路能有效恢復正常的氧化還原平衡和對抵抗小動脈的肌源性反應。此外，通過介導上調Nrf2活性，SFN下調高脂飲食喂養的小鼠主動脈中血管細胞粘附分子-1的表達。我們的數據支持一個模型，在該模型中，通過一種涉及Nrf2依賴性的抗氧化能力下降的機制，主動脈和腸系膜動脈中的氧化應激增加。我們在活體內證明，用SFN靶向Nrf2通路可有效恢復正常的氧化還原平衡，改善糖尿病血管系統中主動脈和腸系膜動脈對乙酰膽堿的內皮反應。這些有益的影響被PM增強，而PM是一種AGE/ALE和其交聯形成的抑制劑。
圖6 與非糖尿病Wistar大鼠相比，蘿卜硫素和吡哆胺對GK大鼠主動脈和腸系膜動脈中Nrf2水平的影響。代表性腸系膜切片顯示非糖尿病性Wistar大鼠（A）、糖尿病性GK大鼠（B）和糖尿病性GK大鼠用SFN（GKS，C）、PM（GKP，D）和SFN+PM（GKSP，E）處理后的Nrf2染色。面板（F）包含不同動脈組中綠色熒光的量化。（G）根據DAPI染色（藍色）的定義，定位于核區的Nrf2標簽（綠色）的熒光強度被量化，并表示為從多個腸系膜動脈段匯集的Wistar大鼠的對照平均值的百分比。（H）不同動脈組主動脈中總Nrf2（左面板）和核Nrf2蛋白水平的Western blot條帶。主動脈中總Nrf2水平（I）和核Nrf2水平（J）的平均密度測量數據，標準化為各自的負荷控制。數據平均值為±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組；#P<0.05，###P<0.001 vs GKP組。
圖7 與非糖尿病Wistar大鼠相比，蘿卜硫素和吡哆胺對GK大鼠主動脈和腸系膜動脈AGE水平的影響。有代表性的主動脈切片顯示非糖尿病Wistar大鼠（A）、糖尿病GK大鼠（B）和糖尿病GK大鼠經SFN（GKS，C）、PM（GKP，D）和SFN+PM（GKSP，E）處理后的AGE染色。面板（K）包含不同動脈組中紅色熒光的量化。有代表性的腸系膜切片顯示了非糖尿病Wistar大鼠（F）、糖尿病GK大鼠（G）和糖尿病GK大鼠用SFN（GKS，H）、PM（GKP，I）和SFN+PM（GKSP，J）處理后的AGE染色。面板（L）包含不同動脈組中紅色熒光的量化。數據平均值為±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組；§p<0.05 vs GKS組。
在糖尿病動物中，氧化應激與AGE的累積成比例增加，其導致血管并發癥的發展。PM已被證明能抑制AGE的形成和脂源性美拉德產物（一種ALE）的形成。它不會直接與葡糖胺重排反應的產物相互作用，但會干擾重排后的氧化反應。此外，PM還可以捕獲活性羰基化合物，抑制AGE和ALE加合物。PM抑制肥胖大鼠的脂血癥，腎與血管并發癥的發生。PM降低氧化應激的部分原因可能是抑制糖基化作用，而糖基化作用是一種直接導致自由基產生的過程。
此外，使用SFN、PM或兩者治療均能顯著降低血管氧化應激，同時增加NO生物利用度，這可以部分解釋對血管功能的有益影響。AGE直接阻斷血管內皮的NO活性并產生活性氧。糖尿病環境的特點是血管的NO水平較低，其應歸于氧化應激和AGE水平增加。SFN和PM對于降低氧化應激，正?；疦O生物利用度非常有效?？赡苤挥挟擜GE與ALE水平以及交聯形成被PM降低，同時抗氧化防御酶（SFN作用）增加時，才有可能促成血管系統中更高水平的NO。
SFN對依賴Nrf2基因的表達的影響已被充分記錄。重要的是，GK大鼠在血管水平上顯示出Nrf2的缺失。類似地，在小鼠糖尿病動脈和人心臟組織中觀察到Nrf2水平降低。此外，先前的研究表明，衰老與血管系統中的Nrf2功能障礙有關，這可能加劇與年齡相關的細胞氧化應激，并增加老化血管對氧化應激誘導的細胞損傷的敏感性。與這些發現一致，我們還發現8個月大的糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈中的Nrf2表達顯著下調，同時細胞核功能顯著下降。Nrf2減少的機制尚不清楚，其解釋也超出了當前研究的范圍；然而，我們的數據表明，在糖尿病的血管系統中發生Nrf2信號傳導的中斷，它可能導致谷胱甘肽的消耗和其他抗氧化防御機制的減少。此外，以前的研究表明，Nrf2誘導了乙二醛酶1的表達，該酶可保護機體免受AGE誘導的蛋白質和DNA損傷，并維持細胞功能。
利用與抑制AGE/ALE水平和交聯形成相關的Nrf2激動劑，并描述其有益作用，可為糖尿病及其血管并發癥中恢復細胞內穩態提供一種新的治療策略。據推測，這些發現導致了新的抗氧化分子的發現和評估，例如Nrf2激動劑和AGE抑制劑，它們可望在早期抑制糖尿病并發癥的發病機制。
結論
總之，我們的研究結果表明，SFN+PM治療內皮功能障礙的益處是多因素的。除了抗氧化功能降低氧化應激外，Nrf2還積極調節NO生物利用度。這些結果提供了令人信服的實驗證據，證明SFN可與PM聯用或不聯用，改善內皮功能障礙和減輕糖尿病引起的血管損傷。在患有長期糖尿病的動物模型中，隨著Nrf2的激活，糖基化降低，內皮功能正?；?，這突出了靶向不同機制以實現主要有益結果的重要性。
綜上所述，我們可以設想未來的策略，不僅包括早期積極治療高血糖癥，還包括同時使用針對AGE形成的活性化合物，以及能夠特異性地針對反應性物種或增強我們抗氧化防御系統的化合物。同時激活Nrf2和抑制AGE/ALE水平與交聯形成可能是一種潛在治療策略。
方法
藥物。PM、苯腎上腺素、乙酰膽堿、N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和超氧化物歧化酶-聚乙烯乙二醇購于SIGMA（St. Louis, MO, USA）。血管舒張劑激活磷蛋白（VASP）、磷酸化血管舒張劑激活磷蛋白（pVASP），β-肌動蛋白、Nrf2、AGE（克隆，No. 6D12）和硝基酪氨酸分別購于Cell Signaling Technology （Danvers, MA, USA）、Abcam plc（Cambridge, UK）、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）、Upstate Biotechnology（Lake placid, NY, USA）與Transgenic Inc（Kobe, Japan）。蘿卜硫素（SFN，L異構體）購于LKT laboratories（St. Paul, MN），DHE購于Invitrogen（Barcelona, Spain）。本研究所用的所有其他化合物與試劑為優級純。
實驗動物。Wistar和GK大鼠來自我們當地的繁殖群體（葡萄牙科英布拉大學醫學院）。將Wistar和GK糖尿病大鼠分為四個實驗組。（1）組（W；GK）用載體（玉米油）維持8周；（2）組用蘿卜硫素（1 mg/kg/天，腹腔內）治療8周（WS；GKS）；（3）組用吡哆胺（100 mg/kg/天，如前）治療8周（WP；GKP）；（4）組用蘿卜硫素和吡哆胺治療8周（WSP；GKSP）。這些動物用一種標準的商業顆粒飼料進行飼養，8個月大時使用。一項初步研究（數據未顯示）表明，1 mg/kg在代謝和內皮功能方面具有更好的效果，并且接近通過食用西蘭花芽苗提取物在人和小鼠體內獲得的生理濃度。
所有動物均按照葡萄牙《實驗動物實驗法》（2004年最后修正案）接受護理，該法基于歐盟指令2010/63/EU對動物實驗采用的實驗動物護理原則。實驗方案由科英布拉大學醫學院ORBEA – IBILI批準。
代謝和氧化應激參數的測定。禁食15小時后，用氯胺酮/氯丙嗪[氯胺酮氯化物（75 mg/kg，im，Parke Davis，Ann Arbor，mi，USA）和氯丙嗪氯化物（2.65 mg/kg，im，lab.vit_ria，Portugal）]麻醉動物并斬首致死。心臟穿刺取血測定血脂?？崭寡逯|（總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯）使用商業可獲得的試劑盒下雨（奧林巴斯-塔格恩·斯塔卡葡萄牙，Olympus-Diagnóstica Portugal, Produtos de Diagnóstico SA, Portugal，葡萄牙）進行定量。血漿游離脂肪酸（FFA）水平使用酶分析試劑盒（Roche Applied Science, Portugal）進行評估。將大鼠置于代謝籠中24小時并收集尿液。尿8-羥基-2-脫氧鳥苷使用EIA試劑盒（Cayman Chemical, Europe）測量。
對于葡萄糖耐量試驗，大鼠先前禁食過夜，并給予腹腔注射葡萄糖（1.75 g kg-1體重）。在注射葡萄糖后0、30、60和120分鐘，通過葡萄糖氧化酶法從尾靜脈中取樣，使用葡萄糖儀（Glucometer Elite Bayer，Portugal S.A.）和兼容的反應測試條測定血糖。用標準計算機程序（GRAPPAD PRISM PCSoftware version 3.0）計算IPGTT曲線的AUC。糖化血紅蛋白（HbA1c）使用A1C NOW+系統測定（Bayer，Portugal S.A.）。
等長張力研究。主動脈被迅速切除，去除結締組織。主動脈分為兩段（4-mm寬）。將環段安裝在不銹鋼三角板之間的單個器官室中，填充含氧（95%氧氣，5%二氧化碳）改良Krebs-Henseleit緩沖液（37°C，pH7.4）（成分單位：mM：NaCl 119；KCl 4.7；CaCl2 1.6；MgSO4 1.2；NaHCO3 25；KH2PO4 1.2；葡萄糖 11.0）。在抑制前列腺素合成的實驗中，吲哚美辛的濃度為10μM。主動脈環的靜息張力為9.8 mN。平衡60分鐘后，所有血管均預先用苯腎上腺素進行收縮。配體刺激受體介導的NO生物利用度通過對乙酰膽堿（Ach，10-9到10-3 M）的濃度依賴性松弛來評估，而硝普鈉（SNP，10-9到10-4 M）被用作非內皮依賴性激動劑。對ACh和SNP的舒張反應以亞最大苯腎上腺素誘導收縮的舒張百分比表示，如前所述獲得量效曲線。
根據Mulvani和Halpern的技術，切除腸系膜上二級動脈段（約200μm的外徑），使其不含脂肪和粘附結締組織，并安裝在肌電圖上。等長張力由PowerLab數據采集系統（Adinstruments，UK）記錄和采集，并使用Labchart 7數據采集和分析軟件（Adinstruments，UK）記錄在計算機上。動脈段在改良的Krebs-Henseleit溶液中平衡30分鐘，保持在37°C，并用5%的二氧化碳進行充氣。根據Mulvani和Halpern的技術，將每只血管放置在相當于每只個體大鼠體內動脈血壓的拉伸下。通過暴露于KCl（125 mM）評估組織收縮性；隨后獲得苯腎上腺素（0.1-30 μM）的累積量效曲線。讓組織重新平衡30分鐘。然后使用腸系膜環研究對以下一種藥物的反應：對乙酰膽堿（Ach，10-9到10-6 M）的反應（在存在和不存在吲哚美辛（10 μM））或硝普鈉（SNP，10-9到10-3 M）評估舒張；舒張根據先前的苯腎上腺素反應曲線，在使用苯腎上腺素預施工后，反應達到最大值的50%左右。在使用腸系膜動脈段的第二系列實驗中，使用L-NAME評估了一氧化氮合酶抑制的急性效應。如上文所述獲得對乙酰膽堿的反應，隨后在L-NAME（300 μM）存在下重復。對ACh和SNP的舒張反應以亞最大苯腎上腺素誘導收縮的舒張百分比表示，并獲得如前所述的濃度-響應曲線。
超氧化物檢測。在37°C的PBS中用DHE（2×10−6 M）在避光加濕室中培養30分鐘未固定的、30 μm厚的近端主動脈段。DHE在與氧反應后被氧化成溴化乙錠，溴化乙錠與細胞核中的DNA結合，發出紅色熒光。對于溴化乙錠的檢測，使用熒光顯微鏡（Leica Dmire200，Wetzlar，德國）獲得圖像。用568 nm濾光片檢測熒光。正常組織和糖尿病組織的處理和成像使用相同的設置平行進行。所有制劑的顯微鏡和照相機設置均保持不變。熒光定量使用IMAGEJ（1.40 g，NIH）。
腸系膜免疫熒光的評估。將腸系膜動脈切片（6μm）用PBS洗滌，固定在冰凍丙酮中10分鐘。隨后在1% Triton X-100且pH值7.4的PBS中透化，用10%羊血清封閉10分鐘，30分鐘后，在含有0.02% BSA的PBS中稀釋一次抗體（PBS/BSA）。添加一級抗體，并在4°C下將切片孵育過夜。孵育后，用PBS/BSA溶液對切片進行廣泛清洗。之后，用二級抗體孵育切片，在PBS/BSA中稀釋1小時。再用甘油凝膠Dako安裝介質（Dako, Carpinteria, CA, USA），安裝之前清洗蓋片。免疫染色腸系膜切片用Leica-Dmire200熒光顯微鏡觀察。免疫染色腸系膜切片用DAPI復染，并按上述方法檢查、拍照和定量DHE熒光。
Western blot分析。用冷PBS清洗內皮完整血管段，并在緩沖液中冷卻，緩沖液中含有：Tris-HCl 50、Nacl 150、乙二胺四乙酸（EDTA）1、乙二醇四乙酸（EGTA）0.1、NP-40、0.1%、SDS 0.1%和脫氧膽酸0.5%。苯甲基磺酰氟（1 mM）、抑肽酶（10μg ml-1）、亮蛋白（10μg ml-1）和胃蛋白酶抑制劑（10μg ml-1）均購于Sigma Chemicals（St. Louis, MO, USA），作為蛋白酶抑制劑加入。以標準方式對組織進行勻漿，然后在14000×g、4°C條件下離心20分鐘。收集上清液并測定總蛋白濃度。將含有40μg蛋白質的樣品加載到12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上，在聚偏氟乙烯膜上運行并電沉積。預染分子量標記蛋白被用作SDS-PAGE的標準。進行麗春紅染色，以驗證轉移的質量，確保蛋白質負載相同。印跡用5%脫脂牛乳在PBS中封閉1h，用抗VASP、pVASP、β-肌動蛋白或Nrf2的一級抗體處理過夜，再用堿性磷酸酶二級抗體孵育1h，用抗VASP磷酸絲氨酸239抗體分析VASP在Ser239（pVASP）的磷酸化狀態，這是一種血管cGMP依賴性蛋白激酶-1活性的可靠生化標志物。血管緊張素的激活由強度比pVASP/tVASP表示。免疫印跡是用ECF免疫印跡檢測系統（Amersham Biosciences）開發的。
使用Bio-Rad蛋白質分析試劑盒測定蛋白質含量。
統計分析。所有數據均采用標準計算機程序（graphpad prism PC軟件版本3.0，ANOVA）進行分析，并以平均值±SEM表示（n=12，每組個體動物數）。采用單因素方差分析，隨后進行個體比較的Bonferroni事后檢驗，評估顯著性差異。P<0.05被認為是顯著的。用單純形算法對劑量響應曲線進行非線性回歸擬合。舒張反應以苯腎上腺素預收縮的百分比表示。量效曲線的比較采用雙向方差分析對重復測量進行評估，隨后進行個體比較的Bonferroni事后檢驗。
在本研究中，我們把吡哆胺（PM）和/或蘿卜硫素（SFN）作為治療干預措施，用于確定NFE2相關因子2（Nrf2）的激動劑是否可以同晚期糖基化終產物（AGE）形成抑制劑一起使用，達到減輕2型糖尿病患者的氧化應激和改善其內皮功能障礙。Goto Kakizaki（GK）大鼠，一種非肥胖型2型糖尿病動物模型，在8周內接受或不接受PM和/或SFN治療，并與年齡匹配的Wistar大鼠進行比較。在治療結束時，評估孤立主動脈和腸系膜動脈中一氧化氮（NO）依賴性和非依賴性的血管舒張。還評估了代謝概況、NO生物利用度和血管氧化應激、AGE和Nrf2水平。糖尿病GK大鼠的Nrf2水平顯著降低，同時氧化應激和內皮功能障礙水平也較高。PM和SFN作為單一療法能夠顯著改善主動脈和腸系膜動脈的內皮功能障礙，降低血管氧化損傷、AGE和HbA1c水平。此外，在GK大鼠中已證明，SFN+PM能更有效地降低全身游離脂肪酸水平，使內皮功能、NO生物利用度和糖化作用正?；?。Nrf2激動劑可與AGE抑制劑和交聯形成抑制劑聯用來治療2型糖尿病內皮功能障礙。
2型糖尿病與氧化應激水平升高和糖基化改變血管功能有關，因此被認為是心血管疾病發展的主要危險因素。許多的糖尿病并發癥都與高血糖和活性氧物種（ROS）生成增加有關，其導致了內皮功能紊亂。對血管舒張劑（如乙酰膽堿）的內皮依賴性舒張功能受損是1型和2型糖尿病實驗模型中導管和阻力動脈的共同特征。我們先前發現糖尿病GK大鼠的氧化應激和糖基化增加，而這種變化導向內皮功能障礙。
糖尿病的治療進展并不能有效地減少糖尿病相關的血管并發癥?？紤]到ROS在內皮功能中的關鍵作用，人們已經作出了相當大的努力來探索降低血管系統中ROS的治療方法。核因子E2（紅系衍生2）相關因子-2（Nrf2）是一種轉錄因子，在細胞對氧化應激的保護中起著關鍵作用。Nrf2被稱為抗氧化劑反應的“主調節器”。通過Nrf2/抗氧化反應元件途徑激動劑誘導內源性抗氧化酶可能是獲得足夠水平的抗氧化劑和減少氧化應激的一種有趣方法。膳食中的NRF2激動劑，如十字花科蔬菜中發現的異硫氰酸鹽蘿卜硫素（SFN），可以增加抗氧化防御，降低血壓，抑制腎臟內促炎信號通路，并預防高血糖引起的內皮細胞代謝紊亂。在糖尿病模型中，Nrf2的激活降低了野生型小鼠的血糖水平，減少了糖尿病相關腎病，但在Nrf2缺乏的小鼠中則沒有。因此，Nrf2誘導劑在血管疾病中的治療潛力巨大，特別是與長期2型糖尿病有關的血管疾病。
表1 8個月大的非糖尿病Wistar大鼠（W）、糖尿病Goto-Kakizaki大鼠（GK）、接受蘿卜硫素處理的GK大鼠（GKS）、接受吡哆胺處理的GK大鼠（GKP）和接受蘿卜硫素與吡哆胺處理的GK大鼠（GKSP）的體重和血脂水平。數據表示為平均值±SE（n=12每組動物）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs W大鼠。與GK大鼠相比，φφφP<0.001。§P<0.05 vs GKS大鼠。#P<0.05 vs GKP大鼠。
此外，在糖尿病情況下的晚期糖基化加速導致血管并發癥。幾位作者已經證明，抑制晚期糖基化終產物（AGE）形成可能是改善糖尿病血管并發癥的一種治療策略。吡哆胺（PM）是維生素B6的一種天然衍生物，已被證明是一種有效的蛋白質糖化和脂質氧化抑制劑。在體外和體內，PM均能抑制AGE的形成，對糖尿病腎病和視網膜病變的治療具有潛在的益處。
蘿卜硫素和吡哆胺有不同的作用機制。因此，我們假設單獨或聯合使用SFN、PM對2型糖尿病模型Goto-Kakizaki（GK）大鼠的內皮依賴性血管反應性、氧化應激和代謝參數具有有益影響。在糖尿病進展的同時，對脂質分布、氧化應激、糖基化和一氧化氮（NO）生物利用度進行了評價。此外，還評估了主動脈和腸系膜動脈對乙酰膽堿（ACH）和硝普鈉（SNP）的內皮依賴性和非依賴性血管敏感性。與Wistar大鼠相比，8個月大的GK大鼠表現出長期糖尿病表型，導管和阻力動脈內皮功能障礙，以及氧化應激增加。單用SFN和PM可以改善孤立動脈中的NO依賴性血管舒張。順帶一提，SFN和PM通過一種機制使主動脈和腸系膜動脈的內皮功能正?；?，該機制包括NO生物利用度的增加，以及氧化應激和AGE水平的降低?？傊?，這些研究表明，針對引起內皮功能障礙的不同機制，抑制AGE形成（PM）和促進抗氧化防御系統（SFN）增強應是對抗糖尿病大血管并發癥的有用工具，因其同時作用于最終導致血管損傷的不同機制。
結論
動物特征。我們實驗中使用的糖尿病大鼠在研究開始時表現出類似的空腹血糖水平。治療前的GK大鼠血糖（GK6M）明顯高于年齡匹配的非糖尿病大鼠（圖1補充）。GK大鼠的體重明顯低于年齡匹配的Wistar大鼠，不同的治療方法并沒有顯著改變這個參數（表1）。在腹膜內葡萄糖耐量試驗（IPGTT）中，GK大鼠與Wistar大鼠相比表現出明顯的葡萄糖不耐（圖1A）。與Wistar大鼠相比，GK大鼠的空腹血糖、葡萄糖曲線下面積（AUC）、HbA1c、總膽固醇和游離脂肪酸（FFA）升高（圖1B、C、D、表1）。如前所述，GK大鼠表現出正常的非HDL膽固醇和甘油三酯水平（表1）。單用SFN或PM治療并沒有顯著改變糖耐量和脂質分布評估（圖1A、C，表1）。同時，PM顯著降低了空腹血糖和HbA1c水平（圖1B、D）。事實上，所有的治療方法都能有效降低GK大鼠的HbA1c水平（圖1D）。此外，使用SFN和PM治療8周可有效降低糖尿病大鼠的血液中FFA濃度（表1），并顯著改善葡萄糖耐受性（圖1A、C）。
NO依賴性血管舒張。8個月大的GK大鼠與年齡匹配的Wistar大鼠相比，苯腎上腺素預收縮后的主動脈環響應乙酰膽堿（ACh）引起的內皮介導血管舒張能力受損（圖2A），但對硝普鈉（SNP）引起的非內皮依賴性舒張在這兩個物種中相似（圖3A）。事實上，在糖尿病大鼠中，苯腎上腺素預收縮主動脈環對乙酰膽堿引起的內皮介導血管最大舒張值降低了49%（圖2A）。在GK大鼠和Wistar大鼠中，用NOS抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和環氧合酶抑制劑吲哚美辛預孵化后的動脈環幾乎完全消除了Ach的松弛作用（圖2補充）。在我們的實驗條件下，其他血管擴張劑的殘余成分約為15%。在主動脈中，沒有觀察到不同組間SNP量效曲線在最大舒張值上的差異（圖3A）。所有GK治療組的最大舒張值顯著改善，對Ach的血管反應性有所改善（圖2A，表2）。用SFN、PM或SFN+PM治療可顯著改善糖尿病大鼠主動脈內皮依賴性血管舒張（圖2A，表2）。這種血管舒張對吲哚美辛不敏感，并被L-NAME阻斷，表明其機制依賴于內源性NO釋放（圖2補充）。此外，在所有GK治療組中觀察到SNP敏感性增加（圖3A，表2）。在腸系膜動脈中，糖尿病大鼠的苯腎上腺素預收縮后動脈環響應Ach引起的內皮介導的最大舒張值降低了36%（圖2B）。此外，糖尿病大鼠響應SNP引起的最大舒張值下降了39%（圖3B）。用SFN、PM或SFN+PM治療能夠改善內皮依賴性血管擴張（圖2B，表3）。類似地，這種作用對吲哚美辛不敏感，并被L-NAME抑制（圖2補充）。表2和表3總結了最大舒張值和EC50值的詳細數據。這些結果表明，單用SFN或PM治療可改善糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈的內皮依賴性血管舒張。與此相關，這些療法能夠使內皮介導的舒張正?；?，并提高主動脈和腸系膜動脈的SNP敏感性（圖2、3）。
圖1 與非糖尿病Wistar（W）大鼠相比，8個月大的糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠蘿卜硫素和吡哆胺處理的效果，腹腔葡萄糖耐量試驗（IPGTT；A）、空腹血糖（B）、葡萄糖曲線下面積（AUC；C）和糖化血紅蛋白（HbA1c）水平（D）。C）計算IPGTT曲線的AUC，以測量葡萄糖耐量受損的程度。數據表示為平均值±SE（n=12）。***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
血管壁的氧化應激。我們確定了SFN、PM或兩者對糖尿病血管系統氧化應激的潛在影響。有趣的是，糖尿病導致糖尿病大動脈中的超氧化物生成量增加了3倍（p<0.001；圖4B，K）。與GK大鼠相比，用SFN、PM和SFN+PM治療的糖尿病大鼠主動脈中二氫乙啶（DHE，ROS熒光探針）的密度顯著降低（圖4C、D、E、K）。此外，糖尿病GK大鼠腸系膜動脈中的免疫反應性硝基酪氨酸（蛋白質氧化生物標志物）水平也升高（p<0.001；圖4G，L），并且用SFN、PM或兩者治療后，這些水平顯著降低（圖4H，I，J，L）。因此，所有療法都能顯著降低糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈的血管氧化損傷。相應地，GK大鼠尿中8-羥基-2’-脫氧鳥苷（8-OHdG，DNA氧化損傷生物標志物）的水平明顯高于年齡匹配的Wistar大鼠（圖4M）。對GK大鼠使用SFN、PM或兩者治療8周后，8-OHdG水平顯著降低（圖4M）。
主動脈中的肺血管緊張素和總血管緊張素。血管舒張劑激活磷蛋白（VASP）在Ser239的磷酸化被證明是生物活性NO和NO-cGMP蛋白激酶G信號通路活性的指標。為了確定NO生物利用度，我們測量了主動脈中磷酸化血管舒張劑激活磷蛋白（pVASP）和總VASP。GK大鼠的主動脈pVASP/tVASP比率明顯低于Wistar大鼠（圖5A，B）。在糖尿病GK大鼠（GKS，GKP；GKSP；圖5A，B）中，用SFN、PM或兩者治療可顯著提高pVASP/TVSP比率。在腸系膜動脈中觀察到類似的情況（數據未列出）。
主動脈和腸系膜動脈中的Nrf2水平。我們隨后量化了不同組大鼠動脈中的Nrf2水平。用Western blot檢測主動脈中的Nrf2水平，以共聚焦顯微鏡觀察腸系膜動脈中的免疫熒光檢來測Nrf2水平。糖尿病大鼠血管中的Nrf2水平明顯低于主動脈和腸系膜動脈中年齡匹配的Wistar大鼠（圖6I，F）。蘿卜硫素治療組（GKS和GKSP）顯著增加了主動脈和腸系膜動脈中的細胞核Nrf2水平（圖6J，G）。Nrf2激動劑SFN增加糖尿病GK大鼠Nrf2的核定位，這可能導致抗氧化防御增加，促進血管氧化應激的減少。在糖尿病GK大鼠的主動脈和腸系膜動脈中，SFN顯著增加了Nrf2的表達（圖6），這表明它同時促進了表達增加和核易位，與其在其他組織中的作用相一致。
主動脈和腸系膜動脈的AGE水平。接下來，我們量化了不同組大鼠動脈中的AGE水平。主動脈和腸系膜動脈的AGE水平用共聚焦顯微鏡測量。糖尿病大鼠主動脈和腸系膜動脈中的AGE水平明顯高于年齡匹配的Wistar大鼠（分別為圖7B、K、G、L）。GK治療組（GKS、GKP和GKSP）主動脈和腸系膜動脈的血管AGE水平顯著降低（圖7K，L）。值得注意的是，PM治療組（GKP，GKSP）血管壁具有正常的AGE水平。
討論
在目前的研究中，蘿卜硫素、吡哆胺及其聯用對GK大鼠的糖尿病內皮功能障礙表現出明顯的治療潛力。用SFN、PM或兩者聯合治療GK大鼠可顯著降低主動脈和腸系膜動脈的內皮功能障礙。在這些血管中，SFN、PM或SFN+PM治療可延緩包括氧化損傷在內的糖尿病內皮功能障礙病理特征的出現。此外，這兩種相關療法都能降低FFA水平，也增加了NO生物利用度，這可以部分解釋2型糖尿病長期模型中內皮功能的正?；?。
GK大鼠為非肥胖2型糖尿病動物模型，具有輕度高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗。長期糖尿病通常與這些動物的胰腺功能喪失有關，其特征也類似于人類疾病進展中的相關特征。該模型與人類2型糖尿病共有包括異常血管反應性在內的多種心血管表型，證明其作為研究糖尿病并發癥的模型是合適的。
在此，我們發現8個月大的GK大鼠具有高血糖，顯著增加的總膽固醇和循環FFA水平的特征。內皮功能障礙在腸系膜動脈和主動脈動脈中都很明顯，其伴隨著氧化應激和糖基化作用升高、NO生物利用度下降和Nrf2水平降低。
Nrf2抗氧化功能在血管疾病中可能很重要。SFN是一種在西蘭花中發現的Nrf2激動劑，增加抗氧化反應元件相關轉錄控制下的保護酶的表達，并防止由高血糖引起的內皮細胞代謝功能障礙。在其它研究的基礎上，結合西蘭花芽苗中SFN的生物利用度，測定了該化合物的濃度。我們估計，在人體飲食可行的生理劑量下，SFN對治療內皮功能障礙具有潛在的治療益處。另一方面，我們最近檢查了2型糖尿病動物模型的AGE水平，發現血漿和血管壁的AGE水平都在增加。如PM的化合物可以降低高水平的AGE，和這種方法對內皮功能有潛在的有益作用。這兩種療法對大血管疾病的治療效果尚未被研究過。在本文中，我們研究了在血管水平上，有或沒有與PM共同抑制年齡形成的SFN的作用。
圖4 與非糖尿病Wistar（W）大鼠相比，蘿卜硫素和吡哆胺處理對GK大鼠全身和血管氧化應激的影響。代表性的DHE染色的主動脈段反映了不同處理（A-E）下的氧氣生成。所有的內皮都朝上。在相同的條件下，糖尿病患者GK（B）的熒光明顯高于正常血管（Wistar，A）。注意到GK主動脈內皮、內膜和介質中反射O2·−水平的熒光增強。糖尿病GK大鼠服用SFN（GKS，C）、PM（GKP，D）和SFN+PM（GKSP，E）后，DHE熒光降低。面板（K）包含不同動脈組中熒光溴化乙錠信號的量化。具有代表性的腸系膜切片用硝基酪氨酸染色顯示非糖尿病Wistar大鼠（F），糖尿病GK大鼠（G），糖尿病GK大鼠SFN（GKS，H）、PM（GKP，I）和SFN+PM（GKSP，J）處理組。面板（L）包含不同動脈組中綠色熒光的量化。（M）不同組大鼠尿8-羥基脫氧鳥苷（8-OHDG）水平。數據表示為平均值±SE（n＝12）。*P<0.05，***P<0.001 vs Wistar組；φP<0.05，φφP<0.01，φφφP<0.001 vs GK組。
單用SFN或PM治療8周并沒有顯著改善甘油三酯、膽固醇和FFA水平。已經證明，PM可以糾正糖尿病和肥胖大鼠的高脂血癥和腎病，可能是通過干擾各種AGE/晚期脂質氧化最終產物（ALE，由脂質氧化形成）的活性羰基中間產物。在不同的動物模型中，更高濃度的PM（400 mg/kg/天）具有這種降脂作用。此外，Nrf2通路具有調節肝臟脂質代謝的功能。Nrf2負性調節許多編碼參與脂質生物合成、脂肪酸去飽和與脂肪酸轉運的酶的基因。相反，0.5 mg/kg的SFN會損害鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠的肝功能并加重的膽固醇水平。此外，在我們的實驗條件下，單用SFN治療不會改變脂質分布。
SFN+PM治療對總膽固醇和甘油三酯水平沒有影響，但卻顯著降低了FFA和HbA1c水平。兩種聯合治療均能改善葡萄糖耐受性，顯著減少葡萄糖曲線下面積。靶向糖基化和抗氧化防御系統的PM和SFN在降低FFA和HbA1c水平方面非常有效。重要的是，SFN和PM治療對胰島素水平沒有影響，這解釋了在治療糖尿病大鼠中觀察到的高血糖。事實上，在所有GK治療組中，血糖水平明顯高于Wistar大鼠。然而，在這些條件下，sfn+pm的血管保護作用是明顯的，表明正常血糖的完全恢復不是血管保護的先決條件。
其他研究者先前報道，在非缺陷Nrf2的野生型小鼠中，Nrf2的激活降低了血糖水平，減少了糖尿病相關腎病。而這項研究中，SFN治療組（GKS）沒有促進血糖水平下降。不同的動物模型和實驗條件可以解釋這些差異。
氧化應激在內皮功能障礙發病機制中的作用已被充分確證。糖尿病增加血管系統中的活性氧，損害抗氧化防御酶，并降低細胞內抗氧化物的水平，創造一個氧化應激增加的環境。在血管模型中，Nrf2通路激動劑通過增加抗氧化/親電反應元件介導的II相酶和抗氧化酶表達（包括NAD（P）H:醌氧化還原酶-1、血紅素氧合酶-1和γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞單位）來恢復氧化還原平衡。在這項研究中，我們提出的證據表明，SFN和PM治療在體內具有抗氧化作用：在糖尿病GK大鼠中，SFN、PM或SFN+PM降低了尿8-OHdG和組織中O2•−陰離子以及硝基酪氨酸的積累量。這種抗氧化作用是已觀察到的內皮功能障礙正?；瘷C制的重要因素。因此，其他研究也報道了不同條件下SFN對氧化應激的抑制作用。在糖尿病db/db微血管系統中，用SFN靶向Nrf2通路能有效恢復正常的氧化還原平衡和對抵抗小動脈的肌源性反應。此外，通過介導上調Nrf2活性，SFN下調高脂飲食喂養的小鼠主動脈中血管細胞粘附分子-1的表達。我們的數據支持一個模型，在該模型中，通過一種涉及Nrf2依賴性的抗氧化能力下降的機制，主動脈和腸系膜動脈中的氧化應激增加。我們在活體內證明，用SFN靶向Nrf2通路可有效恢復正常的氧化還原平衡，改善糖尿病血管系統中主動脈和腸系膜動脈對乙酰膽堿的內皮反應。這些有益的影響被PM增強，而PM是一種AGE/ALE和其交聯形成的抑制劑。
在糖尿病動物中，氧化應激與AGE的累積成比例增加，其導致血管并發癥的發展。PM已被證明能抑制AGE的形成和脂源性美拉德產物（一種ALE）的形成。它不會直接與葡糖胺重排反應的產物相互作用，但會干擾重排后的氧化反應。此外，PM還可以捕獲活性羰基化合物，抑制AGE和ALE加合物。PM抑制肥胖大鼠的脂血癥，腎與血管并發癥的發生。PM降低氧化應激的部分原因可能是抑制糖基化作用，而糖基化作用是一種直接導致自由基產生的過程。
此外，使用SFN、PM或兩者治療均能顯著降低血管氧化應激，同時增加NO生物利用度，這可以部分解釋對血管功能的有益影響。AGE直接阻斷血管內皮的NO活性并產生活性氧。糖尿病環境的特點是血管的NO水平較低，其應歸于氧化應激和AGE水平增加。SFN和PM對于降低氧化應激，正?；疦O生物利用度非常有效?？赡苤挥挟擜GE與ALE水平以及交聯形成被PM降低，同時抗氧化防御酶（SFN作用）增加時，才有可能促成血管系統中更高水平的NO。
SFN對依賴Nrf2基因的表達的影響已被充分記錄。重要的是，GK大鼠在血管水平上顯示出Nrf2的缺失。類似地，在小鼠糖尿病動脈和人心臟組織中觀察到Nrf2水平降低。此外，先前的研究表明，衰老與血管系統中的Nrf2功能障礙有關，這可能加劇與年齡相關的細胞氧化應激，并增加老化血管對氧化應激誘導的細胞損傷的敏感性。與這些發現一致，我們還發現8個月大的糖尿病GK大鼠主動脈和腸系膜動脈中的Nrf2表達顯著下調，同時細胞核功能顯著下降。Nrf2減少的機制尚不清楚，其解釋也超出了當前研究的范圍；然而，我們的數據表明，在糖尿病的血管系統中發生Nrf2信號傳導的中斷，它可能導致谷胱甘肽的消耗和其他抗氧化防御機制的減少。此外，以前的研究表明，Nrf2誘導了乙二醛酶1的表達，該酶可保護機體免受AGE誘導的蛋白質和DNA損傷，并維持細胞功能。
利用與抑制AGE/ALE水平和交聯形成相關的Nrf2激動劑，并描述其有益作用，可為糖尿病及其血管并發癥中恢復細胞內穩態提供一種新的治療策略。據推測，這些發現導致了新的抗氧化分子的發現和評估，例如Nrf2激動劑和AGE抑制劑，它們可望在早期抑制糖尿病并發癥的發病機制。
結論
總之，我們的研究結果表明，SFN+PM治療內皮功能障礙的益處是多因素的。除了抗氧化功能降低氧化應激外，Nrf2還積極調節NO生物利用度。這些結果提供了令人信服的實驗證據，證明SFN可與PM聯用或不聯用，改善內皮功能障礙和減輕糖尿病引起的血管損傷。在患有長期糖尿病的動物模型中，隨著Nrf2的激活，糖基化降低，內皮功能正?；?，這突出了靶向不同機制以實現主要有益結果的重要性。
綜上所述，我們可以設想未來的策略，不僅包括早期積極治療高血糖癥，還包括同時使用針對AGE形成的活性化合物，以及能夠特異性地針對反應性物種或增強我們抗氧化防御系統的化合物。同時激活Nrf2和抑制AGE/ALE水平與交聯形成可能是一種潛在治療策略。
方法
藥物。PM、苯腎上腺素、乙酰膽堿、N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和超氧化物歧化酶-聚乙烯乙二醇購于SIGMA（St. Louis, MO, USA）。血管舒張劑激活磷蛋白（VASP）、磷酸化血管舒張劑激活磷蛋白（pVASP），β-肌動蛋白、Nrf2、AGE（克隆，No. 6D12）和硝基酪氨酸分別購于Cell Signaling Technology （Danvers, MA, USA）、Abcam plc（Cambridge, UK）、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）、Upstate Biotechnology（Lake placid, NY, USA）與Transgenic Inc（Kobe, Japan）。蘿卜硫素（SFN，L異構體）購于LKT laboratories（St. Paul, MN），DHE購于Invitrogen（Barcelona, Spain）。本研究所用的所有其他化合物與試劑為優級純。
實驗動物。Wistar和GK大鼠來自我們當地的繁殖群體（葡萄牙科英布拉大學醫學院）。將Wistar和GK糖尿病大鼠分為四個實驗組。（1）組（W；GK）用載體（玉米油）維持8周；（2）組用蘿卜硫素（1 mg/kg/天，腹腔內）治療8周（WS；GKS）；（3）組用吡哆胺（100 mg/kg/天，如前）治療8周（WP；GKP）；（4）組用蘿卜硫素和吡哆胺治療8周（WSP；GKSP）。這些動物用一種標準的商業顆粒飼料進行飼養，8個月大時使用。一項初步研究（數據未顯示）表明，1 mg/kg在代謝和內皮功能方面具有更好的效果，并且接近通過食用西蘭花芽苗提取物在人和小鼠體內獲得的生理濃度。
所有動物均按照葡萄牙《實驗動物實驗法》（2004年最后修正案）接受護理，該法基于歐盟指令2010/63/EU對動物實驗采用的實驗動物護理原則。實驗方案由科英布拉大學醫學院ORBEA – IBILI批準。
代謝和氧化應激參數的測定。禁食15小時后，用氯胺酮/氯丙嗪[氯胺酮氯化物（75 mg/kg，im，Parke Davis，Ann Arbor，mi，USA）和氯丙嗪氯化物（2.65 mg/kg，im，lab.vit_ria，Portugal）]麻醉動物并斬首致死。心臟穿刺取血測定血脂?？崭寡逯|（總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯）使用商業可獲得的試劑盒下雨（奧林巴斯-塔格恩·斯塔卡葡萄牙，Olympus-Diagnóstica Portugal, Produtos de Diagnóstico SA, Portugal，葡萄牙）進行定量。血漿游離脂肪酸（FFA）水平使用酶分析試劑盒（Roche Applied Science, Portugal）進行評估。將大鼠置于代謝籠中24小時并收集尿液。尿8-羥基-2-脫氧鳥苷使用EIA試劑盒（Cayman Chemical, Europe）測量。
對于葡萄糖耐量試驗，大鼠先前禁食過夜，并給予腹腔注射葡萄糖（1.75 g kg-1體重）。在注射葡萄糖后0、30、60和120分鐘，通過葡萄糖氧化酶法從尾靜脈中取樣，使用葡萄糖儀（Glucometer Elite Bayer，Portugal S.A.）和兼容的反應測試條測定血糖。用標準計算機程序（GRAPPAD PRISM PCSoftware version 3.0）計算IPGTT曲線的AUC。糖化血紅蛋白（HbA1c）使用A1C NOW+系統測定（Bayer，Portugal S.A.）。
等長張力研究。主動脈被迅速切除，去除結締組織。主動脈分為兩段（4-mm寬）。將環段安裝在不銹鋼三角板之間的單個器官室中，填充含氧（95%氧氣，5%二氧化碳）改良Krebs-Henseleit緩沖液（37°C，pH7.4）（成分單位：mM：NaCl 119；KCl 4.7；CaCl2 1.6；MgSO4 1.2；NaHCO3 25；KH2PO4 1.2；葡萄糖 11.0）。在抑制前列腺素合成的實驗中，吲哚美辛的濃度為10μM。主動脈環的靜息張力為9.8 mN。平衡60分鐘后，所有血管均預先用苯腎上腺素進行收縮。配體刺激受體介導的NO生物利用度通過對乙酰膽堿（Ach，10-9到10-3 M）的濃度依賴性松弛來評估，而硝普鈉（SNP，10-9到10-4 M）被用作非內皮依賴性激動劑。對ACh和SNP的舒張反應以亞最大苯腎上腺素誘導收縮的舒張百分比表示，如前所述獲得量效曲線。
根據Mulvani和Halpern的技術，切除腸系膜上二級動脈段（約200μm的外徑），使其不含脂肪和粘附結締組織，并安裝在肌電圖上。等長張力由PowerLab數據采集系統（Adinstruments，UK）記錄和采集，并使用Labchart 7數據采集和分析軟件（Adinstruments，UK）記錄在計算機上。動脈段在改良的Krebs-Henseleit溶液中平衡30分鐘，保持在37°C，并用5%的二氧化碳進行充氣。根據Mulvani和Halpern的技術，將每只血管放置在相當于每只個體大鼠體內動脈血壓的拉伸下。通過暴露于KCl（125 mM）評估組織收縮性；隨后獲得苯腎上腺素（0.1-30 μM）的累積量效曲線。讓組織重新平衡30分鐘。然后使用腸系膜環研究對以下一種藥物的反應：對乙酰膽堿（Ach，10-9到10-6 M）的反應（在存在和不存在吲哚美辛（10 μM））或硝普鈉（SNP，10-9到10-3 M）評估舒張；舒張根據先前的苯腎上腺素反應曲線，在使用苯腎上腺素預施工后，反應達到最大值的50%左右。在使用腸系膜動脈段的第二系列實驗中，使用L-NAME評估了一氧化氮合酶抑制的急性效應。如上文所述獲得對乙酰膽堿的反應，隨后在L-NAME（300 μM）存在下重復。對ACh和SNP的舒張反應以亞最大苯腎上腺素誘導收縮的舒張百分比表示，并獲得如前所述的濃度-響應曲線。
超氧化物檢測。在37°C的PBS中用DHE（2×10−6 M）在避光加濕室中培養30分鐘未固定的、30 μm厚的近端主動脈段。DHE在與氧反應后被氧化成溴化乙錠，溴化乙錠與細胞核中的DNA結合，發出紅色熒光。對于溴化乙錠的檢測，使用熒光顯微鏡（Leica Dmire200，Wetzlar，德國）獲得圖像。用568 nm濾光片檢測熒光。正常組織和糖尿病組織的處理和成像使用相同的設置平行進行。所有制劑的顯微鏡和照相機設置均保持不變。熒光定量使用IMAGEJ（1.40 g，NIH）。
腸系膜免疫熒光的評估。將腸系膜動脈切片（6μm）用PBS洗滌，固定在冰凍丙酮中10分鐘。隨后在1% Triton X-100且pH值7.4的PBS中透化，用10%羊血清封閉10分鐘，30分鐘后，在含有0.02% BSA的PBS中稀釋一次抗體（PBS/BSA）。添加一級抗體，并在4°C下將切片孵育過夜。孵育后，用PBS/BSA溶液對切片進行廣泛清洗。之后，用二級抗體孵育切片，在PBS/BSA中稀釋1小時。再用甘油凝膠Dako安裝介質（Dako, Carpinteria, CA, USA），安裝之前清洗蓋片。免疫染色腸系膜切片用Leica-Dmire200熒光顯微鏡觀察。免疫染色腸系膜切片用DAPI復染，并按上述方法檢查、拍照和定量DHE熒光。
Western blot分析。用冷PBS清洗內皮完整血管段，并在緩沖液中冷卻，緩沖液中含有：Tris-HCl 50、Nacl 150、乙二胺四乙酸（EDTA）1、乙二醇四乙酸（EGTA）0.1、NP-40、0.1%、SDS 0.1%和脫氧膽酸0.5%。苯甲基磺酰氟（1 mM）、抑肽酶（10μg ml-1）、亮蛋白（10μg ml-1）和胃蛋白酶抑制劑（10μg ml-1）均購于Sigma Chemicals（St. Louis, MO, USA），作為蛋白酶抑制劑加入。以標準方式對組織進行勻漿，然后在14000×g、4°C條件下離心20分鐘。收集上清液并測定總蛋白濃度。將含有40μg蛋白質的樣品加載到12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上，在聚偏氟乙烯膜上運行并電沉積。預染分子量標記蛋白被用作SDS-PAGE的標準。進行麗春紅染色，以驗證轉移的質量，確保蛋白質負載相同。印跡用5%脫脂牛乳在PBS中封閉1h，用抗VASP、pVASP、β-肌動蛋白或Nrf2的一級抗體處理過夜，再用堿性磷酸酶二級抗體孵育1h，用抗VASP磷酸絲氨酸239抗體分析VASP在Ser239（pVASP）的磷酸化狀態，這是一種血管cGMP依賴性蛋白激酶-1活性的可靠生化標志物。血管緊張素的激活由強度比pVASP/tVASP表示。免疫印跡是用ECF免疫印跡檢測系統（Amersham Biosciences）開發的。
使用Bio-Rad蛋白質分析試劑盒測定蛋白質含量。
統計分析。所有數據均采用標準計算機程序（graphpad prism PC軟件版本3.0，ANOVA）進行分析，并以平均值±SEM表示（n=12，每組個體動物數）。采用單因素方差分析，隨后進行個體比較的Bonferroni事后檢驗，評估顯著性差異。P<0.05被認為是顯著的。用單純形算法對劑量響應曲線進行非線性回歸擬合。舒張反應以苯腎上腺素預收縮的百分比表示。量效曲線的比較采用雙向方差分析對重復測量進行評估，隨后進行個體比較的Bonferroni事后檢驗。
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