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阿爾茨海默病治療的新靶點：Nrf2通路與自噬之間的串擾
發表于：2021-12-14 作者：admin 來源：本站 點擊量：8793
原文：Zhang W , Feng C , Jiang H . Novel Target for Treating Alzheimer's Diseases: Crosstalk between the Nrf2 Pathway and Autophagy[J]. Ageing Research Reviews, 2020, 65(1):101207.
翻譯：
亮點：
• p62連接Nrf2通路和自噬以維持體內穩態。
• Nrf2的激活和自噬有利于AD治療。
• p62-Keap1-Nrf2軸是治療AD的新型潛在機制。
• 激活p62-Keap1-Nrf2軸的天然化合物是治療AD的有效藥物。
摘要：
在哺乳動物中，Keap1-Nrf2-ARE途徑（以下簡稱“ Nrf2途徑”）和自噬是主要的細胞內防御系統，可對抗氧化損傷并維持體內平衡。p62 / SQSTM1是一種泛素結合的自噬受體蛋白，它連接Nrf2途徑和自噬。p62的磷酸化顯著增強了其對Keap1的親和力，從而誘導Keap1釋放Nrf2，而p62-Keap1異二聚體募集了LC3并介導了Keap1在選擇性自噬途徑中的永久降解。最終，Nrf2積累在細胞質中，然后轉移到細胞核中以激活下游編碼抗氧化酶基因的轉錄，從而保護細胞免受氧化損傷。由于Nrf2也上調了p62基因的表達，因此創建了p62-Keap1-Nrf2正反饋環，該環進一步增強了對細胞的保護作用。研究表明，p62激活的非經典Nrf2途徑是神經變性疾病的重要標志。p62-Keap1-Nrf2正反饋回路和Nrf2通路參與消除AD誘導的ROS和蛋白質聚集。因此，維持p62Keap1-Nrf2正反饋環路（是Nrf2途徑與自噬之間的橋梁）的體內平衡可能是治療AD的潛在目標。
關鍵詞：Nrf2通路、自噬、氧化應激、p62-Keap1-Nrf2正反饋回路、阿爾茨海默病
1. 前言
活性氧(ROS)是正常有氧代謝的副產物，在多種危險因素中產生，如環境應激、衰老和疾病。高水平的ROS破壞DNA結構和膜分布，改變蛋白質結構和功能，導致細胞損傷和死亡。氧化應激反應清除體內過多的ROS，維持體內氧化還原穩態(Yi et al., 2020; Xia et al., 2020)。核因子、紅細胞來源因子2相關因子(Nrf2)是抗氧化防御的關鍵轉錄因子，與Kelch like ech相關蛋白1 (Keap1)相互作用。在氧化應激條件下,由于過多的活性氧產量,Nrf2 Keap1分離,進入細胞核,它結合抗氧化反應的元素(ARE)觸發下游抗氧化酶的表達,如血紅素加氧酶1 (HO1)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和NAD (P) H醌脫氫酶1 (NQO1)。
自噬在真核細胞中廣泛存在，是一種自我修復的生物過程，參與細胞生長、代謝和抗氧化應激。自噬負責清除長壽命或錯誤折疊的蛋白質、脂滴和受損的細胞器，以保持細胞內穩態(Liu et al., 2020)。自噬是一種溶酶體依賴的自我降解途徑。根據底物運輸到溶酶體進行降解的方式，自噬途徑通常分為三種不同類型，這三種類型分別是微自噬、伴侶介導的自噬(CMA，只發生在哺乳動物)和巨自噬(Suzuki et al., 2017)。在微自噬過程中，底物被運輸到溶酶體中，并被小的溶酶體膜的內陷所隔離，這些內陷被擠壓到內腔中(Li and Hochstrasser, 2020)。在CMA中，五肽基序(KFERQ)暴露的錯誤折疊蛋白被熱休克70 kDa蛋白8 (HSPA8/HSC70)識別，進而與溶酶體相關膜蛋白2A (LAMP2A)結合。這些蛋白在溶酶體腔內展開和降解(Dou et al., 2020)。自噬最典型的形式是巨自噬(以下簡稱自噬)。自噬的特點是胞質成分包裹在稱為自噬小體的雙層膜結構中。然后，自噬體與溶酶體膜融合并被水解酶降解。在營養缺乏的情況下，該途徑被激活以提供氨基酸和ATP (Yang et al., 2019)。
p62轉錄被氧化應激、代謝紊亂、疾病和自噬受阻激活，導致細胞質中大量p62聚集。p62的聚集物通過與Nrf2抑制蛋白Keap1直接相互作用，維持Nrf2的慢性激活，并且p62介導Keap1在選擇性自噬途徑中的永久降解(Sanchez-Martin and Komatsu, 2018)。因此，Nrf2信號通路被激活，導致編碼抗氧化酶的基因轉錄上調(Deng et al., 2020)。此外，核內Nrf2促進p62基因的過表達，形成p62- keap1 -Nrf2正反饋軸，導致Nrf2的持續激活。與經典途徑相比，p62介導的選擇性自噬調節Nrf2信號通路屬于非經典機制。越來越多的研究表明，p62-Keap1-Nrf2通路的失調與神經退行性疾病的治療有關(Shah et al., 2018)。因此，本綜述將闡述Nrf2通路、自噬及其串擾在AD治療中的作用。
2. Nrf2 通路
2.1 Keap1的基本結構
Keap1的分子量為66 kDa，由624個氨基酸組成。它是Cullin3 (Cul3)-E3泛素連接酶復合物的底物蛋白，是一種負向調節Nrf2活性的胞質蛋白(Davies et al., 2016)。從結構上看，Keap1由5個功能區組成。第一個區域是N端區域(NTR)。第二個區域是間質區(IVR)，其中含有大量的半胱氨酸殘基。第三個區域是brac -a-brac (BTB)區域，包括broad complex、tramtrack和brac，其中包括一個重要的應力敏感位點半胱氨酸151 (Cys151)。后兩個區域是雙甘氨酸重復或Keleh重復(DGR)區域和C末端區域(CTR) (Dinkovakostova et al., 2017; Deshmukh et al., 2017)。在這些區域中，BTB、IVR和Keleh/DGR域是Keap1的重要功能域。BTB結構域是蛋白質-蛋白質相互作用中一個進化保守的序列。這個結構域可以與另一個Keap1分子的BTB區域結合，形成一個同分二聚體，然后與Nrf2結合。該區域還可以與Cul3結合形成E3 Ub連接酶復合物，導致泛素介導的Nrf2降解(Kansanen et al., 2012; Tao et al., 2017)。在BTB結構域，當半胱氨酸殘基的結構發生改變時，Nrf2蛋白的泛素化和降解將受到抑制。這一過程誘導Nrf2與Keap1分離并與ARE結合以激活編碼抗氧化酶的基因轉錄。IVR區域富含半胱氨酸殘基，對氧化應激敏感，也與Nrf2的穩定性有關。在正常生理條件下，IVR區域參與泛素介導的Nrf2降解。值得一提的是，Cys273和Cys288在抑制Nrf2活性方面發揮了重要作用。當機體被親電體和ROS激活時，IVR結構域發生轉變，導致Nrf2和Keap1相互分離(Magesh et al., 2012)。DGR結構域(包括6個Kelch重復)和CTR區域統稱為DC結構域，是Keap1與細胞質肌動蛋白的結合位點。Keap1同型二聚體中的DGR結構域與Nrf2中Neh2結構域的DLG和ETGE氨基酸基序相互作用，對Nrf2活性產生負調控作用。在外源性或內源性刺激下，通過半胱氨酸失活誘導Keap1 DGR區域構象變化，誘導Keap1-Nrf2蛋白復合物解離，釋放Nrf2進入細胞核。Keap1的基本結構如圖1a所示。
2.2 Nrf2的基本結構
Nrf2分子量為100kda，由624個氨基酸組成。Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)轉錄因子家族，其成員保持cap-n-collar (CNC)結構，而人類Nfe2l2位于2q31上(Tavakkoli et al., 2019; Bottino-Rojas et al., 2018)。根據其生理功能，Nrf2可分為7個高度保守的ECH同源結構域(Nrf2- ECH同源)，包括Neh1到Neh7 (ECH，與雞Nrf2具有CNC同源性的紅血球來源蛋白)。亮氨酸CNC-bZIP區域位于Neh1結構域，可與細胞核中的一種小的肌肉筋膜性纖維肉瘤(Maf)蛋白(即脊椎動物中的MafF、MafG或MafK)結合，并有助于Nrf2與DNA中的ARE結合。隨后，抗氧化酶、Ub酶、II期解毒酶和蛋白酶體的轉錄上調，以抵御細胞中的氧化應激(Karan et al., 2020; Shen et al., 2019)。Neh2結構域是一個由16個氨基酸組成的短肽，其氨基酸序列在69~84之間，位于Nrf2的N端。Nrf2的Neh2結構域包含分別與Keap1具有高親和力和低親和力的ETGE和DLG基序;該區域介導Nrf2的降解并負調控Nrf2的轉錄活性(Tian et al., 2018)。Nrf2 C -末端的Neh3區域是一個可以結合CHD6并激活ARE的重要功能區域(Zhang et al., 2014)。Neh4和Neh5域可以結合激活cAMP反應元素結合蛋白(CREB)協助Nrf2核轉運和以Nrf2-Maf的形式綁定到ARE (Krajka Ku?niak et al ., 2016)。Neh6結構域具有大量的絲氨酸殘基(Chen et al., 2020)，對Nrf2轉錄有負向影響，且不依賴于Keap1 (Chowdhry et al., 2013)，該結構域主要參與Nrf2的降解。其調控機制是DSGIS和DSAPGS的氨基酸基序可通過β-轉介含重復蛋白(β-TrCP)識別，并可誘導Skp1-Cul1-Rbx1/Roc1-β-TrCP Ub連接酶復合物調控Nrf2泛素化介導的降解(Cuadrado, 2015)。Neh7結構域識別視黃素X受體(RXR) (Li et al., 2017)。此外，Nrf2的第40個氨基酸是一個磷酸化位點，該位點的磷酸化導致Nrf2從Keap1中解離。Nrf2的基本結構如圖1b所示。
2.3 ARE的基本結構
ARE位于一些細胞保護基因(抗氧化和自噬相關基因)啟動子區域上游5'端，屬于特定的DNA啟動子聯合序列(Jeddi et al., 2017)。ARE被定義為順式作用的DNA增強因子，負責觸發氧化應激反應，以誘導II期解毒酶和抗氧化酶的表達。ARE廣泛表達于生物體中，其功能是減輕細胞或組織的各種損傷，維持體內平衡。雖然在不同的細胞中ARE略有不同，但共同的核苷酸序列為5'- (G/A) TGA (G/C) XXX GC (G/A) -3' (x代表任何核苷酸)。ARE的基本結構如圖1c所示。
2.4 Nrf2信號通路的調控機制
在漫長的進化過程中，細胞獲得了抵抗外部毒素和內部代謝毒素的能力。最重要的轉錄因子Nrf2調節抗氧化應激反應(Erukainure et al., 2020)[29]。Keap1-Nrf2- ARE通路是激活Nrf2的典型調控通路，Nrf2的活性主要由Keap1調控。在基礎條件下，Keap1的BTB結構域與Cul3 E3 Ub連接酶復合物結合，兩個Keap1分子通過BTB區域形成一個同源二聚體。Keap1-Keap1復合物通過Keap1的DGR域與Nrf2的ETGE和DLG基序以1:1的比例直接結合到Nrf2上(Raghunath et al., 2019)。Nrf2 Neh6域的DSGIS和DSAPGS氨基酸基序與E3 Ub連接酶結合,然后, Ub-蛋白酶體上得Ub轉移到Nrf2ETGE、DLG基序之間的賴氨酸殘基誘導泛素介導的Nrf2降解，因此保持適當的濃度Nrf2(Lee and Ryu, 2017)。
在氧化應激條件下，線粒體產生大量的高活性分子，如ROS (Chen et al., 2020);當ROS含量超過細胞清除能力時，氧化還原系統出現失衡，導致脂質、蛋白質和DNA發生氧化損傷，最終導致細胞凋亡、組織或器官損傷(Liu et al., 2017; Valavanidis et al., 2013)。因此Nrf2通路被顯著激活，具體機制如下。一方面，Keap1 IVR區Cys273和Cys288的巰基被氧化形成二硫鍵(Magesh et al., 2012)，導致空間構象的改變。然后，具有較強結合能力的高親和力ETGE 基序仍然能夠與Keap1緊密結合，而較弱、低親和力的DLG 基序與Keap1分離。Nrf2的空間定位發生改變，不能被泛素蛋白酶體降解。另一方面，Keap1 BTB結構域的Cys151被修飾，產生空間位阻效應，導致Keap1和Cul3解離(Wang et al., 2020)。這破壞了keap1-cul3 E3 泛素連接酶的活性，并抑制了泛素介導的Nrf2降解。當Keap1-Keap1-Nrf2的數量達到飽和時，Keap1同型二聚體在細胞中不能再生，新生成的Nrf2由于自身的保護，不再與Keap1結合。Nrf2遷移到細胞核并與小Maf蛋白結合。然后，Nrf2-Maf與ARE結合，增加抗氧化蛋白和II期解毒酶的轉錄激活(Otsuki and Yamamoto, 2019)。當氧化還原平衡恢復后，Nrf2從細胞核轉位到細胞質，并通過泛素化降解(Pandey et al., 2017)。Nrf2通路的具體調控機制如圖2所示。
3. 自噬的調節機制
從機制上看，自噬主要分為四個階段，即自噬的啟動和誘導、自噬體的擴展和形成、自噬體與溶酶體融合和降解以及降解產物的循環利用(Carlsson and Simonsen, 2015)。在營養充足的條件下，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的重要調節因子，其作用是抑制自噬。mTOR存在于細胞內的兩個復合物中;這些復合物是mTOR復合物1 (mTORC1)和mTOR復合物2 (mTORC2)。mTORC1復合物由mTOR、raptor和富含脯氨酸的Akt底物(PRAS40)組成，raptor是mTORC1激活的重要因素。此外，mTOR、rictor、哺乳動物應激激活的MAP激酶相互作用蛋白(mSIN1)以及與rictor 1和2觀察到的蛋白形成mTORC2復合物。unc -51樣激酶1 (ULK1)是自噬核心機制中最上游的激酶，ULK1的磷酸化是自噬激活的重要決定因素。AMP活化蛋白激酶(AMPK)和mTORC1可以直接調節ULK1 (Atg1 homologs)的磷酸化，這些蛋白是自噬的重要調節蛋白。AMPK正調控自噬，mTORC1通過與ULK1結合抑制ULK1復合物的磷酸化，從而抑制自噬(Noda, 2017)。
3.1自噬的啟動和誘導
正常情況下，自噬被mTORC1抑制，Beclin1與Beclin2在內質網(ER)上形成復合物。在缺乏營養或生長因子的條件下，自噬被認為是非選擇性的，并集中于增加任何胞質蛋白和其他大分子的降解，以提供必需的營養物質。在應激條件下，自噬被認為是選擇性的，有目的地識別底物并將其緊密地結合到新出現的自噬體膜上。相關機制如下。mTORC1失活后，由ULK1、ULK2、Atg13、Atg101和局灶粘附激酶家族相互作用蛋白(FIP200) (Neufeld, 2020)組成的ULK1復合物被AMPK激活后轉運到ER (Chen et al, 2020)。磷酸化的ULK1復合物調控JNK1酶誘導Beclin2的磷酸化，從而改變Beclin2的空間構像，將Beclin1釋放到細胞質中(Xue et al., 2015)。Beclin1對應激高度敏感(Kiruthiga et al., 2020)，并與III類磷脂酰肌醇3激酶(IIIPI3K/PIK3C3;酵母中的Vps34)， Atg14L(也稱為BARKOR;酵母中的Atg14), p150(又稱PIK3R4;酵母菌Vps15)和AMBRA1。PI3K (PI3P)的磷酸化參與了自噬的啟動(Nascimbeni et al., 2017)。部分PI3P復合物征募雙FYVE-containing protein 1 (DECP1)，被ER包裹以增強膜的彎曲度，并形成一個收集自噬相關蛋白的平臺。PI3P與WD重復域磷酸肌醇肽相互作用的另一部分(WIPI, Atg18同源物)在胞漿-液泡(Cvt)通路中發揮重要作用。這個階段是自噬前體膜的形成(Cao et al., 2019;Nakatogawa, 2020)。
3.2自噬體的延伸和形成
自噬前體的雙層膜被不斷拉長以形成自噬體。在延長階段需要兩個Atg接合系統被ub -蛋白酶體修飾。一個系統是Atg12-Atg5-Atg16L共軛系統，錨定自噬體的外膜，另一個系統是Atg8/LC3共軛系統，同時連接內膜和外膜。Atg12-Atg5-Atg16L復合物是自噬體形成所必需的。自噬激活后，ub樣蛋白Atg12被e1樣ub激活酶和e2樣ub結合酶誘導，通過Atg7和Atg10作用與Atg5結合。Atg16的低聚物與Atg12-Atg5的共軛物結合，形成位于外膜的Atg12-Atg5- atg16l復合物(Liet al., 2020)。在非自噬條件下，LC3(在酵母中也被稱為Atg8同源蛋白)以proLC3的非活性形式存在。自噬激活后，LC3通過Atg4、Atg7、Atg3的順序作用轉化為LC3I。然后Atg12-Atg5-Atg16L復合物介導LC3I與磷脂酰乙醇胺(PE)結合，形成具有膜結合能力的活性蛋白LC3II。LC3II與p62的LIR結構域相互作用，影響擴張吞噬團的曲率和自噬前體的形成。自噬前體膜通過誘導LC3II不斷延伸形成囊狀自噬體，嵌入雙層膜表面(Noda and Inagaki, 2015)。
3.3自噬體與溶酶體的融合和產物降解
自噬體與溶酶體的融合是通過兩種機制:一個機制是直接的自噬體與溶酶體融合形成自吞噬泡,和其他機制的結合與成熟的核內體自噬體形成自噬核內體,后來搬到溶酶體與溶酶體融合。細胞核周圍的微管組織中心(MTOC)含有大量的溶酶體。在壓力作用下，膜附LC3-II蛋白在肌動蛋白復合物的作用下移動到MTOC附近。同時，溶酶體向MTOC移動，加速了相互融合的效率。在自噬溶酶體形成初期，ATP為溶酶體膜上的質子泵提供能量，增加溶酶體主動攝取H+。陽離子和陰離子泵可以維持溶酶體中的離子電流平衡(如Ca2+、K+和Cl-)。當內溶酶體的pH值在4.5 ~ 5.0時，水解酶被激活，困在自噬體內的LC3II蛋白與底物一起最終被降解。自噬體外膜上LC3-II被Atg4降解回收?；诙嗵堑哪さ鞍?如LAMP1和LAMP2)嵌入溶酶體膜表面，可以防止溶酶體自身降解。自噬溶酶體融合后，水解酶降解底物，包括脂肪酸和氨基酸在內的水解物參與細胞內循環，提供能量(Zhao et al., 2020)。具體流程如圖3所示。
4. 細胞中的p62-Keap1-Nrf2軸
4.1 p62的基本結構
p62，又稱SQSTM1，是一種與ub結合的自噬受體，分子量為62 kDa。p62主要位于細胞質中，可在細胞質與細胞核之間轉運。p62含有440個氨基酸,由9功能域:phox bem1域(PB1), ZZ-type鋅指域(ZZ) TRAF6綁定域(TB),核本地化信號(NLS),核出口信號(NES), PEST域,LC3交互領域(LIR), Keap1相互作用域(KIR)和C末端 Ub相關(UBA)域(Lin et al., 2013)。p62通過PB1結構域的selfoligomerization形成聚合體，該結構域還與PKC、胞外信號調節激酶5 (MEK5)和鄰近的BRCA1基因1蛋白(NBR1)相互作用，形成異源二聚體。c端UBA結構域，對Ub具有高親和力的高度保守序列(Katsuragi et al., 2015; Denk et al., 2019)，對于隔離轉運到自噬體中的泛素化底物至關重要。此外，UBA結構域的S403和S407可被靶向形成Ub鏈48K的蛋白聚合物(Zhang et al., 2019)，并被由兩個亞基組成的26S蛋白酶體識別，這兩個亞基是一個20S蛋白酶體和一個19S調節粒子。19S粒子識別泛素化的p62蛋白，并通過狹窄的孔將其轉移至20S蛋白酶體，20S蛋白酶體將底物消化為包含2-24個氨基酸的肽，并為細胞再利用提供必要的材料(Jakobi et al., 2020; Cohen-Kaplan et al., 2017)。ZZ域與受體相互作用蛋白1 (RIP1)調節腫瘤壞死通路和NF-κB信號(Yan et al ., 2017)。TB結構域結合TRAF6催化賴氨酸(K)殘基位點(63位)多聚泛素鏈的形成(Kim et al., 2019)。ZZ和TB區域之間的未知區域與raptor相互作用，激活雷帕霉素復合物1的機制靶點。NLS和NES結構域分別是核定位信號和核輸出信號，NLS2的磷酸化在促進p62在細胞質和細胞核之間的轉運中發揮了重要作用(Pankiv et al., 2010)。阻止p62轉運到細胞質會導致泛素化蛋白聚集物在細胞核內積聚，促進p62的核易位。研究表明，p62定位于細胞核中泛素化蛋白聚集物上，提示p62可能被核泛素化蛋白聚集物降解(Wang et al., 2019; Kleine et al., 2012)。PEST結構域包括脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)，也稱為PEST序列。在真核細胞中，PEST序列被認為是直接與泛素蛋白酶體系統(UPS)相互作用的靶點，并且PEST的磷酸化與蛋白質的快速降解和更新有關。但是，PEST序列不是p62的特征域;在一些代謝酶、轉錄因子和細胞周期調節蛋白中也發現了它(Schnupf et al., 2006)。LIR結構域與LC3結合，在自噬體的形成和降解中發揮關鍵作用(Islam et al., 2018)。DPSTGE基序(氨基酸位置349-354)(Deng et al., 2019; Sánchez-Martín et al., 2019)p62的KIR結構域與Nrf2的Neh2結構域的基序ETGE相似，負責p62和Keap1在精氨酸380、415和483位的直接相互作用(Lau et al, 2010)。因此Nrf2通路被激活。p62的基本結構如圖4所示。p62是多種細胞信號通路中的樞紐蛋白，包括Nrf2、自噬、NF-kB和Caspase 8等通路。本文主要介紹p62在Keap1-Nrf2通路和自噬通路中的作用。
4.2 Nrf2通路與自噬之間的串擾
據我們所知，p62是一種自噬適配器蛋白，p62的LIR結構域在細胞質中與LC3結合，對自噬的調節和自噬體膜的延伸具有積極作用(Lamark et al., 2017; Jiang and Mizushima, 2015)。最近的研究發現，p62參與調控Nrf2通路，使Nrf2易位到細胞核，激活下游的抗氧化基因(Bartolini et al., 2018)。p62調節氧化應激反應中的Nrf2主要有3種機制。(1)磷酸化p62的KIR結構域可能與Keap1的DGR結構域相識別，形成p62-Keap1復合物，并被UPS途徑清除;(2) p62通過組裝p62Keap1復合物和LC3形成LC3-p62-Keap1復合物來控制Keap1的周轉率，LC3-p62-Keap1復合物被選擇性自噬消除(Liao et al., 2019); (3)游離p62直接進入細胞核調控ARE，啟動下游基因的表達。當細胞受到ROS或親電體刺激時，p62與Keap1 DGR結構域的結合親和力可通過磷酸化p62 KIR區域內的S351/349顯著提高(Schnupf et al., 2006)。此外，p62過表達可通過與Ub鏈48K結合，通過UPS清除p62-Keap1復合物，顯著降低Keap1的半衰期(Copple et al., 2010)。此外，Nrf2的DLG基序與Keap1的DGR結構域相互作用的解離有助于LC3-p62-Keap1聚集體的形成。這些聚集物被63- k連接的多聚素選擇性修飾，并被包裹在自噬體中，通過自噬途徑促進Keap1的降解(Dikic, 2017)。此外，Sestrin-2與ULK1相互作用，誘導p62在S409位點的UBA結構域磷酸化(Ro et al., 2014; Rhee and Bae, 2015);并顯著促進LC3-p62-Keap1聚集物的自噬降解，從而上調Nrf2信號通路(Yang et al., 2020)。一些研究表明，氧化應激介導的p62蛋白水平的升高會產生p62- keap1 -Nrf2正反饋回路，導致Nrf2的持續激活(Polonen et al., 2019)。
有趣的是，Nrf2也能刺激自噬。當大量的Nrf2把進入細胞核,它是通過小加結合蛋白質的轉錄上調自噬相關基因,包括Atg5 p62, Map1lc3b,啟動者中包括的核苷酸序列,從而上調 Atg 5,p62, LC3B蛋白的表達 (Frias et al., 2020;Ho and Gorski, 2019)。最近的研究表明Nrf2與ARE結合后還可以誘導蛋白酶體、自噬相關基因、Sestrin2和p62的表達(Dikic, 2017)。此外，Sestrin2可以通過抑制mTORC1的表達來激活自噬(Pasha et al., 2017)。因此Nrf2可直接或間接觸發選擇性自噬。綜上所述，Nrf2通路通過p62-Keap1-Nrf2正反饋回路與自噬之間存在相互調節關系。
5. p62-Keap1-Nrf2 軸在AD中的作用
神經退行性疾病也稱為蛋白質聚集性疾病。典型的神經退行性疾病有阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病(HD)、肌萎縮性側索硬化癥(ALS)和多發性硬化癥(MS)。神經退行性疾病的發病機制是慢性,漸進,和不可逆轉的中樞神經系統(CNS)或周圍神經系統的結構和功能的變性(Poga?nik et al., 2020)。越來越多的證據表明，大量的ROS和親電體是導致神經退行性疾病發生發展的主要因素。目前，治療神經退行性疾病的一個有前景的策略是增加抗氧化基因的表達，包括解毒蛋白和抗氧化酶(Singh and Devasahayam, 2020)。研究表明Nrf2通路在調節神經退行性疾病中具有重要意義。已經證實，Nrf2通路的激活可以誘導細胞抗氧化保護，減少神經損傷，延緩神經退行性疾病的病情進展(Leung et al., 2019)。自噬通過參與衰老細胞器的消除和錯誤折疊蛋白的降解，在維持神經細胞在中樞神經系統內的穩態中發揮重要作用(Corti et al., 2020)。神經變性疾病與Nrf2通路抑制和自噬功能障礙有關，導致ROS積累、細胞器衰老和錯誤折疊蛋白(Darios and Stevanin, 2020; Kim S., Indu et al., 2020)。本文主要闡述了Nrf2通路和自噬在AD中的作用。
5.1 Nrf2通路對AD的影響
AD的發病機制以大腦皮層和海馬的神經元和突觸結構受損為特征。AD的主要組織學特征是細胞外低聚淀粉樣蛋白肽(Aβ)的積累和沉積以及tau蛋白的過度磷酸化，它們與神經纖維纏結(NFT)的形成并行。這些異常蛋白的增加導致神經退行性變、神經元丟失，最終導致AD (Fão et al., 2019; Gulisano et al., 2018)。一些研究表明，活性氧(ROS)的產生和神經元損傷與活性氧的積累有關。Nrf2的表達隨著年齡的增長而顯著下降，細胞質中的ROS不能立即清除，這是AD的主要原因之一。這一觀察結果提示Nrf2可能是AD的潛在治療靶點(Kahroba and Davatgaran-Taghipour, 2020)。此外，在AD患者大腦中，Nrf2調控的抗氧化酶SOD1和GSH-Px活性降低(Omar et al., 1999)。當SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHJournal Px) 在AD模型顯著增加,可以降低氧化應激損傷,抑制過度磷酸化tau,減少炎癥推遲AD發展,增加AD小鼠的學習和記憶能力(Ji et al., 2020; Gu et al., 2020)。同樣，Nrf2敲除顯著影響AD小鼠的空間學習和記憶，并表現出與衰老AD患者相同的癥狀。Nrf2相關通路激活劑對AD有較好的治療效果(Rojo et al., 2017; Wei et al., 2020)，這表明Nrf2通路在治療AD中是有益的。
5.2自噬對AD的影響
在AD患者中，選擇性自噬與Aβ和過度磷酸化tau蛋白的消除有關。自噬抑制會降低記憶和認知能力，因此自噬受阻是AD的另一個主要原因(Li et al., 2020)。已證實用相應的激活物觸發自噬有助于減少AD病理進展(Vegh et al., 2019; Song et al., 2020)。此外，Nrf2通路和選擇性自噬參與了一個正反饋回路。有證據表明Nrf2的激活與神經退行性疾病中多聚素化蛋白p62的調控有關。自噬適配器p62直接與Keap1相互作用，從而釋放Nrf2并將其導向細胞核。然后Nrf2與ARE結合，增加編碼抗氧化酶基因的轉錄。有趣的是，Nrf2也會上調p62基因轉錄，從而產生p62- keap1 -Nrf2正反饋軸，導致Nrf2的持續激活(Pajares et al., 2016)。越來越多的研究表明，自噬的激活和p62-Keap1-Nrf2正反饋回路是改善神經退行性疾病發展的保護機制(Buratta et al., 2020; Lattante et al., 2015)。因此，自噬與Nrf2通路之間的串擾可能是治療神經退行性疾病的一個新的靶點。其調節機制如圖5所示。
綜上所述，由于衰老可降低Nrf2的活性或抑制自噬，如細胞外低聚體Aβ、細胞內NFT和過度磷酸化的tau蛋白不能及時清除，會導致大量ROS的產生，進而造成海馬和突觸結構損傷；這是AD的主要發病機制。p62-Keap1-Nrf2正反饋回路是Nrf2通路與自噬之間的橋梁，在AD的發生發展中發揮重要作用。天然活性物質可以長期服用，因為它們產生的副作用更少。為了探討利用天然產物靶向Nrf2通路、自噬和p62-Keap1-Nrf2反饋回路治療AD的研究現狀，我們檢索了2018年1月1日至2020年4月20日的相關英漢文獻。英語文獻在PubMed網站(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)進行搜索。關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)”共61篇，關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(Keap1 Nrf2)”共20篇，關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)和(Nrf2)”共5篇。中文文獻通過中國知網(CNKI)網站(https://www.cnki.net/)、萬方數據網站(http://www.wanfangdata.com.cn/index.html)和VIP網站(http://qikan.cqvip.com/)的高級搜索進行檢索。在主題選項下，關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)”獲得17篇期刊文章，關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(Nrf2)”獲得10篇期刊文章，關鍵詞“((阿爾茨海默病)和(p62)和(Nrf2)”未獲得任何文章。每篇文章后手動檢查排除不符合需求的研究,我們發現總共有19篇文章關于天然化合物或中藥配方能夠激活Nrf2途徑治療AD,13個文章通過p62調節自噬干預AD,而且只有1篇關于調節Nrf2通路和自噬干預AD。具體總結見表1-2。綜上所述，通過靶向p62-Keap1-Nrf2反饋回路治療AD的策略研究，有望為未來新藥的開發提供新的前景。
圖1為Keap1 Nrf2的基本結構。a. Keap1含有624個氨基酸，由5個功能區組成。BTB、IVR和Keleh/DGR域是Keap1的重要功能域。IVR結構域含有大量半胱氨酸殘基，其中Cys273和Cys288是重要位點。該區域對氧化應激敏感，也與Nrf2的穩定性有關。BTB結構域包括一個重要的應激敏感位點(Cys151)，可以形成一個同源二聚體并與Cul3結合形成E3 Ub連接酶復合物。Keap1同型二聚體的DGR結構域與Nrf2的Neh2結構域的DLG和ETGE基序相互作用，對Nrf2的活性產生負調控作用。DGR和CTR統稱為DC區域，是Keap1與細胞質肌動蛋白的結合區域。b. Nrf2含有624個氨基酸，可分為7個Neh結構域。Neh1結構域可以識別sMaf，并有助于Nrf2與DNA中的ARE結合。Neh2結構域包含促進Nrf2與Keap1結合的ETGE和DLG基序，介導Nrf2的降解，負向調節Nrf2的轉錄活性。Nrf2 c末端的Neh3區域是一個重要的功能區域，可以結合CHD6并激活ARE來調節相關基因的轉錄。Neh4和Neh5結構域可與CREB結合，協助Nrf2轉位進入細胞核。Neh6區域的DSGIS和DSAPGS基序可以被β-TrCP識別，這對Nrf2轉錄有負面影響。Neh7域可以實現對RXR的識別。c. ARE位于啟動子抗氧化和自噬相關基因的上游5'端區域，包括一個特定的DNA啟動子結合序列。不同細胞的ARE略有不同，但共同的核苷酸序列為5'- (G/A) TGA (G/C) XXX GC (G/A) -3' (x代表任何核苷酸)。
圖2 Keap1-Nrf2-ARE通路的調控機制。在生理條件下，Keap1的BTB結構域與Cul3 E3 Ub連接酶復合物結合，兩個Keap1分子通過BTB區域形成一個同源二聚體。Keap1-Keap1復合物與Nrf2在Keap1的DGR域以及Nrf2的ETGE和DLG基序以1:1的比例結合。Nrf2 Neh6區域的DSGIS和DSAPGS基序與E3 Ub連接酶結合，然后將Ub-蛋白酶體上的Ub轉移到Nrf2的ETGE和DLG基序之間的賴氨酸殘基上，誘導泛素介導的Nrf2降解。在氧化應激條件下，IVR區域的空間構象發生改變。Nrf2的弱、低親和基序DLG與Keap1分離。Keap1 BTB結構域的Cys151被修飾，導致Keap1和Cul3的解離。游離的Nrf2易位到細胞核并與小Maf蛋白結合。Nrf2-Maf與ARE結合，增加抗氧化蛋白和II期解毒酶的轉錄激活。
圖3自噬過程。自噬可分為四個主要階段:自噬的啟動和誘導、自噬體的擴展和形成、自噬體的融合和降解、降解產物的循環。ULK1復合物、AMPK和PI3K復合物誘導自噬的啟動。延長相需要Atg12-Atg5-Atg16L和Atg8/LC3偶聯體系。溶酶體向MTOC移動，加速了自噬體和溶酶體相互融合的效率。包括脂肪酸和氨基酸在內的水解產物參與了細胞內的循環以提供能量。
圖4 p62的基本結構。p62通過PB1結構域的自寡聚形成聚集體，該結構域還與PKC、MEK5和NBR1相互作用形成異源二聚體。UBA結構域對48-K聚泛素具有高親和力，S403和S407的磷酸化對自噬小體中泛素化底物的隔離至關重要。ZZ域與RIP1調節腫瘤壞死通路和NF-κB信號。TB結構域與TRAF6結合，催化多聚泛素鏈的形成。NLS域和NES域分別是核定位信號和核輸出信號。PEST區域直接與UPS相互作用，而PEST的磷酸化與蛋白質的快速降解和更新有關。LIR和KIR結構域分別與LC3和Keap1結合并參與自噬。
圖5神經退行性疾病中Nrf2通路與自噬之間的串擾。Nrf2在氧化應激反應中主要有3種調控機制。(1) Nrf2的弱、低親和力DLG基序與Keap1分離。Keap1的BTB結構域被修改，導致Keap1被UPS途徑清除。(2)磷酸化p62的KIR結構域識別Keap1的DGR結構域，形成p62-Keap1復合物，并被UPS途徑清除。(3) p62通過將p62-Keap1和LC3組裝成LC3-p62-Keap1復合物來控制Keap1的周轉，并通過選擇性自噬降解。通過這些途徑釋放的Nrf2允許其轉位到細胞核，并通過Maf蛋白與ARE結合。一方面，增加SOD、CAT、Nqo1和HO1的表達可以減少ROS的積累。另一方面，促進p62、Atg5、LC3和Sestrin2的轉錄激活自噬并降解蛋白聚集物。Nrf2通路的激活和選擇性自噬可以緩解AD的發展。
翻譯：
阿爾茨海默病治療的新靶點：Nrf2通路與自噬之間的串擾
亮點：
• p62連接Nrf2通路和自噬以維持體內穩態。
• Nrf2的激活和自噬有利于AD治療。
• p62-Keap1-Nrf2軸是治療AD的新型潛在機制。
• 激活p62-Keap1-Nrf2軸的天然化合物是治療AD的有效藥物。
摘要：
在哺乳動物中，Keap1-Nrf2-ARE途徑（以下簡稱“ Nrf2途徑”）和自噬是主要的細胞內防御系統，可對抗氧化損傷并維持體內平衡。p62 / SQSTM1是一種泛素結合的自噬受體蛋白，它連接Nrf2途徑和自噬。p62的磷酸化顯著增強了其對Keap1的親和力，從而誘導Keap1釋放Nrf2，而p62-Keap1異二聚體募集了LC3并介導了Keap1在選擇性自噬途徑中的永久降解。最終，Nrf2積累在細胞質中，然后轉移到細胞核中以激活下游編碼抗氧化酶基因的轉錄，從而保護細胞免受氧化損傷。由于Nrf2也上調了p62基因的表達，因此創建了p62-Keap1-Nrf2正反饋環，該環進一步增強了對細胞的保護作用。研究表明，p62激活的非經典Nrf2途徑是神經變性疾病的重要標志。p62-Keap1-Nrf2正反饋回路和Nrf2通路參與消除AD誘導的ROS和蛋白質聚集。因此，維持p62Keap1-Nrf2正反饋環路（是Nrf2途徑與自噬之間的橋梁）的體內平衡可能是治療AD的潛在目標。
關鍵詞：Nrf2通路、自噬、氧化應激、p62-Keap1-Nrf2正反饋回路、阿爾茨海默病
1. 前言
活性氧(ROS)是正常有氧代謝的副產物，在多種危險因素中產生，如環境應激、衰老和疾病。高水平的ROS破壞DNA結構和膜分布，改變蛋白質結構和功能，導致細胞損傷和死亡。氧化應激反應清除體內過多的ROS，維持體內氧化還原穩態(Yi et al., 2020; Xia et al., 2020)。核因子、紅細胞來源因子2相關因子(Nrf2)是抗氧化防御的關鍵轉錄因子，與Kelch like ech相關蛋白1 (Keap1)相互作用。在氧化應激條件下,由于過多的活性氧產量,Nrf2 Keap1分離,進入細胞核,它結合抗氧化反應的元素(ARE)觸發下游抗氧化酶的表達,如血紅素加氧酶1 (HO1)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和NAD (P) H醌脫氫酶1 (NQO1)。
自噬在真核細胞中廣泛存在，是一種自我修復的生物過程，參與細胞生長、代謝和抗氧化應激。自噬負責清除長壽命或錯誤折疊的蛋白質、脂滴和受損的細胞器，以保持細胞內穩態(Liu et al., 2020)。自噬是一種溶酶體依賴的自我降解途徑。根據底物運輸到溶酶體進行降解的方式，自噬途徑通常分為三種不同類型，這三種類型分別是微自噬、伴侶介導的自噬(CMA，只發生在哺乳動物)和巨自噬(Suzuki et al., 2017)。在微自噬過程中，底物被運輸到溶酶體中，并被小的溶酶體膜的內陷所隔離，這些內陷被擠壓到內腔中(Li and Hochstrasser, 2020)。在CMA中，五肽基序(KFERQ)暴露的錯誤折疊蛋白被熱休克70 kDa蛋白8 (HSPA8/HSC70)識別，進而與溶酶體相關膜蛋白2A (LAMP2A)結合。這些蛋白在溶酶體腔內展開和降解(Dou et al., 2020)。自噬最典型的形式是巨自噬(以下簡稱自噬)。自噬的特點是胞質成分包裹在稱為自噬小體的雙層膜結構中。然后，自噬體與溶酶體膜融合并被水解酶降解。在營養缺乏的情況下，該途徑被激活以提供氨基酸和ATP (Yang et al., 2019)。
p62轉錄被氧化應激、代謝紊亂、疾病和自噬受阻激活，導致細胞質中大量p62聚集。p62的聚集物通過與Nrf2抑制蛋白Keap1直接相互作用，維持Nrf2的慢性激活，并且p62介導Keap1在選擇性自噬途徑中的永久降解(Sanchez-Martin and Komatsu, 2018)。因此，Nrf2信號通路被激活，導致編碼抗氧化酶的基因轉錄上調(Deng et al., 2020)。此外，核內Nrf2促進p62基因的過表達，形成p62- keap1 -Nrf2正反饋軸，導致Nrf2的持續激活。與經典途徑相比，p62介導的選擇性自噬調節Nrf2信號通路屬于非經典機制。越來越多的研究表明，p62-Keap1-Nrf2通路的失調與神經退行性疾病的治療有關(Shah et al., 2018)。因此，本綜述將闡述Nrf2通路、自噬及其串擾在AD治療中的作用。
2. Nrf2 通路
2.1 Keap1的基本結構
Keap1的分子量為66 kDa，由624個氨基酸組成。它是Cullin3 (Cul3)-E3泛素連接酶復合物的底物蛋白，是一種負向調節Nrf2活性的胞質蛋白(Davies et al., 2016)。從結構上看，Keap1由5個功能區組成。第一個區域是N端區域(NTR)。第二個區域是間質區(IVR)，其中含有大量的半胱氨酸殘基。第三個區域是brac -a-brac (BTB)區域，包括broad complex、tramtrack和brac，其中包括一個重要的應力敏感位點半胱氨酸151 (Cys151)。后兩個區域是雙甘氨酸重復或Keleh重復(DGR)區域和C末端區域(CTR) (Dinkovakostova et al., 2017; Deshmukh et al., 2017)。在這些區域中，BTB、IVR和Keleh/DGR域是Keap1的重要功能域。BTB結構域是蛋白質-蛋白質相互作用中一個進化保守的序列。這個結構域可以與另一個Keap1分子的BTB區域結合，形成一個同分二聚體，然后與Nrf2結合。該區域還可以與Cul3結合形成E3 Ub連接酶復合物，導致泛素介導的Nrf2降解(Kansanen et al., 2012; Tao et al., 2017)。在BTB結構域，當半胱氨酸殘基的結構發生改變時，Nrf2蛋白的泛素化和降解將受到抑制。這一過程誘導Nrf2與Keap1分離并與ARE結合以激活編碼抗氧化酶的基因轉錄。IVR區域富含半胱氨酸殘基，對氧化應激敏感，也與Nrf2的穩定性有關。在正常生理條件下，IVR區域參與泛素介導的Nrf2降解。值得一提的是，Cys273和Cys288在抑制Nrf2活性方面發揮了重要作用。當機體被親電體和ROS激活時，IVR結構域發生轉變，導致Nrf2和Keap1相互分離(Magesh et al., 2012)。DGR結構域(包括6個Kelch重復)和CTR區域統稱為DC結構域，是Keap1與細胞質肌動蛋白的結合位點。Keap1同型二聚體中的DGR結構域與Nrf2中Neh2結構域的DLG和ETGE氨基酸基序相互作用，對Nrf2活性產生負調控作用。在外源性或內源性刺激下，通過半胱氨酸失活誘導Keap1 DGR區域構象變化，誘導Keap1-Nrf2蛋白復合物解離，釋放Nrf2進入細胞核。Keap1的基本結構如圖1a所示。
2.2 Nrf2的基本結構
Nrf2分子量為100kda，由624個氨基酸組成。Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)轉錄因子家族，其成員保持cap-n-collar (CNC)結構，而人類Nfe2l2位于2q31上(Tavakkoli et al., 2019; Bottino-Rojas et al., 2018)。根據其生理功能，Nrf2可分為7個高度保守的ECH同源結構域(Nrf2- ECH同源)，包括Neh1到Neh7 (ECH，與雞Nrf2具有CNC同源性的紅血球來源蛋白)。亮氨酸CNC-bZIP區域位于Neh1結構域，可與細胞核中的一種小的肌肉筋膜性纖維肉瘤(Maf)蛋白(即脊椎動物中的MafF、MafG或MafK)結合，并有助于Nrf2與DNA中的ARE結合。隨后，抗氧化酶、Ub酶、II期解毒酶和蛋白酶體的轉錄上調，以抵御細胞中的氧化應激(Karan et al., 2020; Shen et al., 2019)。Neh2結構域是一個由16個氨基酸組成的短肽，其氨基酸序列在69~84之間，位于Nrf2的N端。Nrf2的Neh2結構域包含分別與Keap1具有高親和力和低親和力的ETGE和DLG基序;該區域介導Nrf2的降解并負調控Nrf2的轉錄活性(Tian et al., 2018)。Nrf2 C -末端的Neh3區域是一個可以結合CHD6并激活ARE的重要功能區域(Zhang et al., 2014)。Neh4和Neh5域可以結合激活cAMP反應元素結合蛋白(CREB)協助Nrf2核轉運和以Nrf2-Maf的形式綁定到ARE (Krajka Ku?niak et al ., 2016)。Neh6結構域具有大量的絲氨酸殘基(Chen et al., 2020)，對Nrf2轉錄有負向影響，且不依賴于Keap1 (Chowdhry et al., 2013)，該結構域主要參與Nrf2的降解。其調控機制是DSGIS和DSAPGS的氨基酸基序可通過β-轉介含重復蛋白(β-TrCP)識別，并可誘導Skp1-Cul1-Rbx1/Roc1-β-TrCP Ub連接酶復合物調控Nrf2泛素化介導的降解(Cuadrado, 2015)。Neh7結構域識別視黃素X受體(RXR) (Li et al., 2017)。此外，Nrf2的第40個氨基酸是一個磷酸化位點，該位點的磷酸化導致Nrf2從Keap1中解離。Nrf2的基本結構如圖1b所示。
2.3 ARE的基本結構
ARE位于一些細胞保護基因(抗氧化和自噬相關基因)啟動子區域上游5'端，屬于特定的DNA啟動子聯合序列(Jeddi et al., 2017)。ARE被定義為順式作用的DNA增強因子，負責觸發氧化應激反應，以誘導II期解毒酶和抗氧化酶的表達。ARE廣泛表達于生物體中，其功能是減輕細胞或組織的各種損傷，維持體內平衡。雖然在不同的細胞中ARE略有不同，但共同的核苷酸序列為5'- (G/A) TGA (G/C) XXX GC (G/A) -3' (x代表任何核苷酸)。ARE的基本結構如圖1c所示。
2.4 Nrf2信號通路的調控機制
在漫長的進化過程中，細胞獲得了抵抗外部毒素和內部代謝毒素的能力。最重要的轉錄因子Nrf2調節抗氧化應激反應(Erukainure et al., 2020)[29]。Keap1-Nrf2- ARE通路是激活Nrf2的典型調控通路，Nrf2的活性主要由Keap1調控。在基礎條件下，Keap1的BTB結構域與Cul3 E3 Ub連接酶復合物結合，兩個Keap1分子通過BTB區域形成一個同源二聚體。Keap1-Keap1復合物通過Keap1的DGR域與Nrf2的ETGE和DLG基序以1:1的比例直接結合到Nrf2上(Raghunath et al., 2019)。Nrf2 Neh6域的DSGIS和DSAPGS氨基酸基序與E3 Ub連接酶結合,然后, Ub-蛋白酶體上得Ub轉移到Nrf2ETGE、DLG基序之間的賴氨酸殘基誘導泛素介導的Nrf2降解，因此保持適當的濃度Nrf2(Lee and Ryu, 2017)。
在氧化應激條件下，線粒體產生大量的高活性分子，如ROS (Chen et al., 2020);當ROS含量超過細胞清除能力時，氧化還原系統出現失衡，導致脂質、蛋白質和DNA發生氧化損傷，最終導致細胞凋亡、組織或器官損傷(Liu et al., 2017; Valavanidis et al., 2013)。因此Nrf2通路被顯著激活，具體機制如下。一方面，Keap1 IVR區Cys273和Cys288的巰基被氧化形成二硫鍵(Magesh et al., 2012)，導致空間構象的改變。然后，具有較強結合能力的高親和力ETGE 基序仍然能夠與Keap1緊密結合，而較弱、低親和力的DLG 基序與Keap1分離。Nrf2的空間定位發生改變，不能被泛素蛋白酶體降解。另一方面，Keap1 BTB結構域的Cys151被修飾，產生空間位阻效應，導致Keap1和Cul3解離(Wang et al., 2020)。這破壞了keap1-cul3 E3 泛素連接酶的活性，并抑制了泛素介導的Nrf2降解。當Keap1-Keap1-Nrf2的數量達到飽和時，Keap1同型二聚體在細胞中不能再生，新生成的Nrf2由于自身的保護，不再與Keap1結合。Nrf2遷移到細胞核并與小Maf蛋白結合。然后，Nrf2-Maf與ARE結合，增加抗氧化蛋白和II期解毒酶的轉錄激活(Otsuki and Yamamoto, 2019)。當氧化還原平衡恢復后，Nrf2從細胞核轉位到細胞質，并通過泛素化降解(Pandey et al., 2017)。Nrf2通路的具體調控機制如圖2所示。
3. 自噬的調節機制
從機制上看，自噬主要分為四個階段，即自噬的啟動和誘導、自噬體的擴展和形成、自噬體與溶酶體融合和降解以及降解產物的循環利用(Carlsson and Simonsen, 2015)。在營養充足的條件下，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的重要調節因子，其作用是抑制自噬。mTOR存在于細胞內的兩個復合物中;這些復合物是mTOR復合物1 (mTORC1)和mTOR復合物2 (mTORC2)。mTORC1復合物由mTOR、raptor和富含脯氨酸的Akt底物(PRAS40)組成，raptor是mTORC1激活的重要因素。此外，mTOR、rictor、哺乳動物應激激活的MAP激酶相互作用蛋白(mSIN1)以及與rictor 1和2觀察到的蛋白形成mTORC2復合物。unc -51樣激酶1 (ULK1)是自噬核心機制中最上游的激酶，ULK1的磷酸化是自噬激活的重要決定因素。AMP活化蛋白激酶(AMPK)和mTORC1可以直接調節ULK1 (Atg1 homologs)的磷酸化，這些蛋白是自噬的重要調節蛋白。AMPK正調控自噬，mTORC1通過與ULK1結合抑制ULK1復合物的磷酸化，從而抑制自噬(Noda, 2017)。
3.1自噬的啟動和誘導
正常情況下，自噬被mTORC1抑制，Beclin1與Beclin2在內質網(ER)上形成復合物。在缺乏營養或生長因子的條件下，自噬被認為是非選擇性的，并集中于增加任何胞質蛋白和其他大分子的降解，以提供必需的營養物質。在應激條件下，自噬被認為是選擇性的，有目的地識別底物并將其緊密地結合到新出現的自噬體膜上。相關機制如下。mTORC1失活后，由ULK1、ULK2、Atg13、Atg101和局灶粘附激酶家族相互作用蛋白(FIP200) (Neufeld, 2020)組成的ULK1復合物被AMPK激活后轉運到ER (Chen et al, 2020)。磷酸化的ULK1復合物調控JNK1酶誘導Beclin2的磷酸化，從而改變Beclin2的空間構像，將Beclin1釋放到細胞質中(Xue et al., 2015)。Beclin1對應激高度敏感(Kiruthiga et al., 2020)，并與III類磷脂酰肌醇3激酶(IIIPI3K/PIK3C3;酵母中的Vps34)， Atg14L(也稱為BARKOR;酵母中的Atg14), p150(又稱PIK3R4;酵母菌Vps15)和AMBRA1。PI3K (PI3P)的磷酸化參與了自噬的啟動(Nascimbeni et al., 2017)。部分PI3P復合物征募雙FYVE-containing protein 1 (DECP1)，被ER包裹以增強膜的彎曲度，并形成一個收集自噬相關蛋白的平臺。PI3P與WD重復域磷酸肌醇肽相互作用的另一部分(WIPI, Atg18同源物)在胞漿-液泡(Cvt)通路中發揮重要作用。這個階段是自噬前體膜的形成(Cao et al., 2019;Nakatogawa, 2020)。
3.2自噬體的延伸和形成
自噬前體的雙層膜被不斷拉長以形成自噬體。在延長階段需要兩個Atg接合系統被ub -蛋白酶體修飾。一個系統是Atg12-Atg5-Atg16L共軛系統，錨定自噬體的外膜，另一個系統是Atg8/LC3共軛系統，同時連接內膜和外膜。Atg12-Atg5-Atg16L復合物是自噬體形成所必需的。自噬激活后，ub樣蛋白Atg12被e1樣ub激活酶和e2樣ub結合酶誘導，通過Atg7和Atg10作用與Atg5結合。Atg16的低聚物與Atg12-Atg5的共軛物結合，形成位于外膜的Atg12-Atg5- atg16l復合物(Liet al., 2020)。在非自噬條件下，LC3(在酵母中也被稱為Atg8同源蛋白)以proLC3的非活性形式存在。自噬激活后，LC3通過Atg4、Atg7、Atg3的順序作用轉化為LC3I。然后Atg12-Atg5-Atg16L復合物介導LC3I與磷脂酰乙醇胺(PE)結合，形成具有膜結合能力的活性蛋白LC3II。LC3II與p62的LIR結構域相互作用，影響擴張吞噬團的曲率和自噬前體的形成。自噬前體膜通過誘導LC3II不斷延伸形成囊狀自噬體，嵌入雙層膜表面(Noda and Inagaki, 2015)。
3.3自噬體與溶酶體的融合和產物降解
自噬體與溶酶體的融合是通過兩種機制:一個機制是直接的自噬體與溶酶體融合形成自吞噬泡,和其他機制的結合與成熟的核內體自噬體形成自噬核內體,后來搬到溶酶體與溶酶體融合。細胞核周圍的微管組織中心(MTOC)含有大量的溶酶體。在壓力作用下，膜附LC3-II蛋白在肌動蛋白復合物的作用下移動到MTOC附近。同時，溶酶體向MTOC移動，加速了相互融合的效率。在自噬溶酶體形成初期，ATP為溶酶體膜上的質子泵提供能量，增加溶酶體主動攝取H+。陽離子和陰離子泵可以維持溶酶體中的離子電流平衡(如Ca2+、K+和Cl-)。當內溶酶體的pH值在4.5 ~ 5.0時，水解酶被激活，困在自噬體內的LC3II蛋白與底物一起最終被降解。自噬體外膜上LC3-II被Atg4降解回收?；诙嗵堑哪さ鞍?如LAMP1和LAMP2)嵌入溶酶體膜表面，可以防止溶酶體自身降解。自噬溶酶體融合后，水解酶降解底物，包括脂肪酸和氨基酸在內的水解物參與細胞內循環，提供能量(Zhao et al., 2020)。具體流程如圖3所示。
4. 細胞中的p62-Keap1-Nrf2軸
4.1 p62的基本結構
p62，又稱SQSTM1，是一種與ub結合的自噬受體，分子量為62 kDa。p62主要位于細胞質中，可在細胞質與細胞核之間轉運。p62含有440個氨基酸,由9功能域:phox bem1域(PB1), ZZ-type鋅指域(ZZ) TRAF6綁定域(TB),核本地化信號(NLS),核出口信號(NES), PEST域,LC3交互領域(LIR), Keap1相互作用域(KIR)和C末端 Ub相關(UBA)域(Lin et al., 2013)。p62通過PB1結構域的selfoligomerization形成聚合體，該結構域還與PKC、胞外信號調節激酶5 (MEK5)和鄰近的BRCA1基因1蛋白(NBR1)相互作用，形成異源二聚體。c端UBA結構域，對Ub具有高親和力的高度保守序列(Katsuragi et al., 2015; Denk et al., 2019)，對于隔離轉運到自噬體中的泛素化底物至關重要。此外，UBA結構域的S403和S407可被靶向形成Ub鏈48K的蛋白聚合物(Zhang et al., 2019)，并被由兩個亞基組成的26S蛋白酶體識別，這兩個亞基是一個20S蛋白酶體和一個19S調節粒子。19S粒子識別泛素化的p62蛋白，并通過狹窄的孔將其轉移至20S蛋白酶體，20S蛋白酶體將底物消化為包含2-24個氨基酸的肽，并為細胞再利用提供必要的材料(Jakobi et al., 2020; Cohen-Kaplan et al., 2017)。ZZ域與受體相互作用蛋白1 (RIP1)調節腫瘤壞死通路和NF-κB信號(Yan et al ., 2017)。TB結構域結合TRAF6催化賴氨酸(K)殘基位點(63位)多聚泛素鏈的形成(Kim et al., 2019)。ZZ和TB區域之間的未知區域與raptor相互作用，激活雷帕霉素復合物1的機制靶點。NLS和NES結構域分別是核定位信號和核輸出信號，NLS2的磷酸化在促進p62在細胞質和細胞核之間的轉運中發揮了重要作用(Pankiv et al., 2010)。阻止p62轉運到細胞質會導致泛素化蛋白聚集物在細胞核內積聚，促進p62的核易位。研究表明，p62定位于細胞核中泛素化蛋白聚集物上，提示p62可能被核泛素化蛋白聚集物降解(Wang et al., 2019; Kleine et al., 2012)。PEST結構域包括脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)，也稱為PEST序列。在真核細胞中，PEST序列被認為是直接與泛素蛋白酶體系統(UPS)相互作用的靶點，并且PEST的磷酸化與蛋白質的快速降解和更新有關。但是，PEST序列不是p62的特征域;在一些代謝酶、轉錄因子和細胞周期調節蛋白中也發現了它(Schnupf et al., 2006)。LIR結構域與LC3結合，在自噬體的形成和降解中發揮關鍵作用(Islam et al., 2018)。DPSTGE基序(氨基酸位置349-354)(Deng et al., 2019; Sánchez-Martín et al., 2019)p62的KIR結構域與Nrf2的Neh2結構域的基序ETGE相似，負責p62和Keap1在精氨酸380、415和483位的直接相互作用(Lau et al, 2010)。因此Nrf2通路被激活。p62的基本結構如圖4所示。p62是多種細胞信號通路中的樞紐蛋白，包括Nrf2、自噬、NF-kB和Caspase 8等通路。本文主要介紹p62在Keap1-Nrf2通路和自噬通路中的作用。
4.2 Nrf2通路與自噬之間的串擾
據我們所知，p62是一種自噬適配器蛋白，p62的LIR結構域在細胞質中與LC3結合，對自噬的調節和自噬體膜的延伸具有積極作用(Lamark et al., 2017; Jiang and Mizushima, 2015)。最近的研究發現，p62參與調控Nrf2通路，使Nrf2易位到細胞核，激活下游的抗氧化基因(Bartolini et al., 2018)。p62調節氧化應激反應中的Nrf2主要有3種機制。(1)磷酸化p62的KIR結構域可能與Keap1的DGR結構域相識別，形成p62-Keap1復合物，并被UPS途徑清除;(2) p62通過組裝p62Keap1復合物和LC3形成LC3-p62-Keap1復合物來控制Keap1的周轉率，LC3-p62-Keap1復合物被選擇性自噬消除(Liao et al., 2019); (3)游離p62直接進入細胞核調控ARE，啟動下游基因的表達。當細胞受到ROS或親電體刺激時，p62與Keap1 DGR結構域的結合親和力可通過磷酸化p62 KIR區域內的S351/349顯著提高(Schnupf et al., 2006)。此外，p62過表達可通過與Ub鏈48K結合，通過UPS清除p62-Keap1復合物，顯著降低Keap1的半衰期(Copple et al., 2010)。此外，Nrf2的DLG基序與Keap1的DGR結構域相互作用的解離有助于LC3-p62-Keap1聚集體的形成。這些聚集物被63- k連接的多聚素選擇性修飾，并被包裹在自噬體中，通過自噬途徑促進Keap1的降解(Dikic, 2017)。此外，Sestrin-2與ULK1相互作用，誘導p62在S409位點的UBA結構域磷酸化(Ro et al., 2014; Rhee and Bae, 2015);并顯著促進LC3-p62-Keap1聚集物的自噬降解，從而上調Nrf2信號通路(Yang et al., 2020)。一些研究表明，氧化應激介導的p62蛋白水平的升高會產生p62- keap1 -Nrf2正反饋回路，導致Nrf2的持續激活(Polonen et al., 2019)。
有趣的是，Nrf2也能刺激自噬。當大量的Nrf2把進入細胞核,它是通過小加結合蛋白質的轉錄上調自噬相關基因,包括Atg5 p62, Map1lc3b,啟動者中包括的核苷酸序列,從而上調 Atg 5,p62, LC3B蛋白的表達 (Frias et al., 2020;Ho and Gorski, 2019)。最近的研究表明Nrf2與ARE結合后還可以誘導蛋白酶體、自噬相關基因、Sestrin2和p62的表達(Dikic, 2017)。此外，Sestrin2可以通過抑制mTORC1的表達來激活自噬(Pasha et al., 2017)。因此Nrf2可直接或間接觸發選擇性自噬。綜上所述，Nrf2通路通過p62-Keap1-Nrf2正反饋回路與自噬之間存在相互調節關系。
5. p62-Keap1-Nrf2 軸在AD中的作用
神經退行性疾病也稱為蛋白質聚集性疾病。典型的神經退行性疾病有阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病(HD)、肌萎縮性側索硬化癥(ALS)和多發性硬化癥(MS)。神經退行性疾病的發病機制是慢性,漸進,和不可逆轉的中樞神經系統(CNS)或周圍神經系統的結構和功能的變性(Poga?nik et al., 2020)。越來越多的證據表明，大量的ROS和親電體是導致神經退行性疾病發生發展的主要因素。目前，治療神經退行性疾病的一個有前景的策略是增加抗氧化基因的表達，包括解毒蛋白和抗氧化酶(Singh and Devasahayam, 2020)。研究表明Nrf2通路在調節神經退行性疾病中具有重要意義。已經證實，Nrf2通路的激活可以誘導細胞抗氧化保護，減少神經損傷，延緩神經退行性疾病的病情進展(Leung et al., 2019)。自噬通過參與衰老細胞器的消除和錯誤折疊蛋白的降解，在維持神經細胞在中樞神經系統內的穩態中發揮重要作用(Corti et al., 2020)。神經變性疾病與Nrf2通路抑制和自噬功能障礙有關，導致ROS積累、細胞器衰老和錯誤折疊蛋白(Darios and Stevanin, 2020; Kim S., Indu et al., 2020)。本文主要闡述了Nrf2通路和自噬在AD中的作用。
5.1 Nrf2通路對AD的影響
AD的發病機制以大腦皮層和海馬的神經元和突觸結構受損為特征。AD的主要組織學特征是細胞外低聚淀粉樣蛋白肽(Aβ)的積累和沉積以及tau蛋白的過度磷酸化，它們與神經纖維纏結(NFT)的形成并行。這些異常蛋白的增加導致神經退行性變、神經元丟失，最終導致AD (Fão et al., 2019; Gulisano et al., 2018)。一些研究表明，活性氧(ROS)的產生和神經元損傷與活性氧的積累有關。Nrf2的表達隨著年齡的增長而顯著下降，細胞質中的ROS不能立即清除，這是AD的主要原因之一。這一觀察結果提示Nrf2可能是AD的潛在治療靶點(Kahroba and Davatgaran-Taghipour, 2020)。此外，在AD患者大腦中，Nrf2調控的抗氧化酶SOD1和GSH-Px活性降低(Omar et al., 1999)。當SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHJournal Px) 在AD模型顯著增加,可以降低氧化應激損傷,抑制過度磷酸化tau,減少炎癥推遲AD發展,增加AD小鼠的學習和記憶能力(Ji et al., 2020; Gu et al., 2020)。同樣，Nrf2敲除顯著影響AD小鼠的空間學習和記憶，并表現出與衰老AD患者相同的癥狀。Nrf2相關通路激活劑對AD有較好的治療效果(Rojo et al., 2017; Wei et al., 2020)，這表明Nrf2通路在治療AD中是有益的。
5.2自噬對AD的影響
在AD患者中，選擇性自噬與Aβ和過度磷酸化tau蛋白的消除有關。自噬抑制會降低記憶和認知能力，因此自噬受阻是AD的另一個主要原因(Li et al., 2020)。已證實用相應的激活物觸發自噬有助于減少AD病理進展(Vegh et al., 2019; Song et al., 2020)。此外，Nrf2通路和選擇性自噬參與了一個正反饋回路。有證據表明Nrf2的激活與神經退行性疾病中多聚素化蛋白p62的調控有關。自噬適配器p62直接與Keap1相互作用，從而釋放Nrf2并將其導向細胞核。然后Nrf2與ARE結合，增加編碼抗氧化酶基因的轉錄。有趣的是，Nrf2也會上調p62基因轉錄，從而產生p62- keap1 -Nrf2正反饋軸，導致Nrf2的持續激活(Pajares et al., 2016)。越來越多的研究表明，自噬的激活和p62-Keap1-Nrf2正反饋回路是改善神經退行性疾病發展的保護機制(Buratta et al., 2020; Lattante et al., 2015)。因此，自噬與Nrf2通路之間的串擾可能是治療神經退行性疾病的一個新的靶點。其調節機制如圖5所示。
綜上所述，由于衰老可降低Nrf2的活性或抑制自噬，如細胞外低聚體Aβ、細胞內NFT和過度磷酸化的tau蛋白不能及時清除，會導致大量ROS的產生，進而造成海馬和突觸結構損傷；這是AD的主要發病機制。p62-Keap1-Nrf2正反饋回路是Nrf2通路與自噬之間的橋梁，在AD的發生發展中發揮重要作用。天然活性物質可以長期服用，因為它們產生的副作用更少。為了探討利用天然產物靶向Nrf2通路、自噬和p62-Keap1-Nrf2反饋回路治療AD的研究現狀，我們檢索了2018年1月1日至2020年4月20日的相關英漢文獻。英語文獻在PubMed網站(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)進行搜索。關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)”共61篇，關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(Keap1 Nrf2)”共20篇，關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)和(Nrf2)”共5篇。中文文獻通過中國知網(CNKI)網站(https://www.cnki.net/)、萬方數據網站(http://www.wanfangdata.com.cn/index.html)和VIP網站(http://qikan.cqvip.com/)的高級搜索進行檢索。在主題選項下，關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(p62)”獲得17篇期刊文章，關鍵詞“(阿爾茨海默病)和(Nrf2)”獲得10篇期刊文章，關鍵詞“((阿爾茨海默病)和(p62)和(Nrf2)”未獲得任何文章。每篇文章后手動檢查排除不符合需求的研究,我們發現總共有19篇文章關于天然化合物或中藥配方能夠激活Nrf2途徑治療AD,13個文章通過p62調節自噬干預AD,而且只有1篇關于調節Nrf2通路和自噬干預AD。具體總結見表1-2。綜上所述，通過靶向p62-Keap1-Nrf2反饋回路治療AD的策略研究，有望為未來新藥的開發提供新的前景。
圖1為Keap1 Nrf2的基本結構。a. Keap1含有624個氨基酸，由5個功能區組成。BTB、IVR和Keleh/DGR域是Keap1的重要功能域。IVR結構域含有大量半胱氨酸殘基，其中Cys273和Cys288是重要位點。該區域對氧化應激敏感，也與Nrf2的穩定性有關。BTB結構域包括一個重要的應激敏感位點(Cys151)，可以形成一個同源二聚體并與Cul3結合形成E3 Ub連接酶復合物。Keap1同型二聚體的DGR結構域與Nrf2的Neh2結構域的DLG和ETGE基序相互作用，對Nrf2的活性產生負調控作用。DGR和CTR統稱為DC區域，是Keap1與細胞質肌動蛋白的結合區域。b. Nrf2含有624個氨基酸，可分為7個Neh結構域。Neh1結構域可以識別sMaf，并有助于Nrf2與DNA中的ARE結合。Neh2結構域包含促進Nrf2與Keap1結合的ETGE和DLG基序，介導Nrf2的降解，負向調節Nrf2的轉錄活性。Nrf2 c末端的Neh3區域是一個重要的功能區域，可以結合CHD6并激活ARE來調節相關基因的轉錄。Neh4和Neh5結構域可與CREB結合，協助Nrf2轉位進入細胞核。Neh6區域的DSGIS和DSAPGS基序可以被β-TrCP識別，這對Nrf2轉錄有負面影響。Neh7域可以實現對RXR的識別。c. ARE位于啟動子抗氧化和自噬相關基因的上游5'端區域，包括一個特定的DNA啟動子結合序列。不同細胞的ARE略有不同，但共同的核苷酸序列為5'- (G/A) TGA (G/C) XXX GC (G/A) -3' (x代表任何核苷酸)。
圖2 Keap1-Nrf2-ARE通路的調控機制。在生理條件下，Keap1的BTB結構域與Cul3 E3 Ub連接酶復合物結合，兩個Keap1分子通過BTB區域形成一個同源二聚體。Keap1-Keap1復合物與Nrf2在Keap1的DGR域以及Nrf2的ETGE和DLG基序以1:1的比例結合。Nrf2 Neh6區域的DSGIS和DSAPGS基序與E3 Ub連接酶結合，然后將Ub-蛋白酶體上的Ub轉移到Nrf2的ETGE和DLG基序之間的賴氨酸殘基上，誘導泛素介導的Nrf2降解。在氧化應激條件下，IVR區域的空間構象發生改變。Nrf2的弱、低親和基序DLG與Keap1分離。Keap1 BTB結構域的Cys151被修飾，導致Keap1和Cul3的解離。游離的Nrf2易位到細胞核并與小Maf蛋白結合。Nrf2-Maf與ARE結合，增加抗氧化蛋白和II期解毒酶的轉錄激活。
圖3自噬過程。自噬可分為四個主要階段:自噬的啟動和誘導、自噬體的擴展和形成、自噬體的融合和降解、降解產物的循環。ULK1復合物、AMPK和PI3K復合物誘導自噬的啟動。延長相需要Atg12-Atg5-Atg16L和Atg8/LC3偶聯體系。溶酶體向MTOC移動，加速了自噬體和溶酶體相互融合的效率。包括脂肪酸和氨基酸在內的水解產物參與了細胞內的循環以提供能量。
圖4 p62的基本結構。p62通過PB1結構域的自寡聚形成聚集體，該結構域還與PKC、MEK5和NBR1相互作用形成異源二聚體。UBA結構域對48-K聚泛素具有高親和力，S403和S407的磷酸化對自噬小體中泛素化底物的隔離至關重要。ZZ域與RIP1調節腫瘤壞死通路和NF-κB信號。TB結構域與TRAF6結合，催化多聚泛素鏈的形成。NLS域和NES域分別是核定位信號和核輸出信號。PEST區域直接與UPS相互作用，而PEST的磷酸化與蛋白質的快速降解和更新有關。LIR和KIR結構域分別與LC3和Keap1結合并參與自噬。
圖5神經退行性疾病中Nrf2通路與自噬之間的串擾。Nrf2在氧化應激反應中主要有3種調控機制。(1) Nrf2的弱、低親和力DLG基序與Keap1分離。Keap1的BTB結構域被修改，導致Keap1被UPS途徑清除。(2)磷酸化p62的KIR結構域識別Keap1的DGR結構域，形成p62-Keap1復合物，并被UPS途徑清除。(3) p62通過將p62-Keap1和LC3組裝成LC3-p62-Keap1復合物來控制Keap1的周轉，并通過選擇性自噬降解。通過這些途徑釋放的Nrf2允許其轉位到細胞核，并通過Maf蛋白與ARE結合。一方面，增加SOD、CAT、Nqo1和HO1的表達可以減少ROS的積累。另一方面，促進p62、Atg5、LC3和Sestrin2的轉錄激活自噬并降解蛋白聚集物。Nrf2通路的激活和選擇性自噬可以緩解AD的發展。
本文由福山生物整理翻譯，轉載請注明出處。
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