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Nrf2缺乏對老年骨骼肌線粒體氧化應激的影響
發表于：2021-07-06 作者：admin 來源：本站 點擊量：6385
原文：Yu K , Tamura Y , Takahashi K , et al. Effects of Nrf2 deficiency on mitochondrial oxidative stress in aged skeletal muscle[J]. Physiological Reports, 2019, 7(3).
翻譯：
2日本東京日本體育科學大學運動生理學系
3日本東京大學體育科學系
4日本筑波大學綜合人類科學研究科
關鍵詞 衰老，線粒體，氧化應激，骨骼肌肉
摘要 氧化應激和線粒體功能障礙與衰老過程有關。然而，核因子紅細胞系2相關因子2（Nrf2）在衰老過程中對骨骼肌的作用仍有待闡明。在目前的研究中，我們評估了缺乏Nrf2，它被稱為氧化還原穩態的主要調節因子，是否會促進骨骼肌中與年齡相關的線粒體功能障礙和肌肉萎縮。在這里，我們揭示了在老年Nrf2敲除的（KO）小鼠中，由于Nrf2-靶向抗氧化基因的表達降低，線粒體中氧化應激的標志物4-羥基壬烯醛和蛋白質羰基強烈升高。線粒體呼吸隨著衰老而下降，然而，敲除Nrf2 和年齡匹配的野生型小鼠之間沒有差異。類似地，與年輕野生型小鼠相比，老年野生型和敲除Nrf2 小鼠中的細胞色素c氧化酶活性較低。老年敲除Nrf2 小鼠肌肉中Mfn1和Mfn2 mRNA的表達較低。在老化的敲除Nrf2小鼠中，每消耗氧氣的線粒體活性氧產生增加。敲除Nrf2 對體重歸一化的肌肉質量沒有影響。這些結果表明，Nrf2缺乏會加劇與年齡相關的線粒體氧化應激，但不會影響骨骼肌呼吸功能的下降。
引言
衰老的特征在于骨骼肌質量和功能的喪失，這種現象稱為肌肉減少癥。這種肌肉功能的喪失導致身體虛弱和死亡的風險增加（Cruz-Jentoft等，2010）。因此，了解肌肉萎縮隨老化的機制對于識別治療目標和促進健康非常重要。衰老過程被認為是由氧化應激驅動的，最初由Harman 于1956年提出作為自由基理論。鑒于線粒體電子傳遞鏈是活性氧（ROS）的主要來源，線粒體被認為在肌肉減少癥中起著至關重要的作用。與該假設一致，許多研究表明老年骨骼肌中ROS產生增加，與線粒體功能障礙和線粒體細胞凋亡易感性增加相關（Chabi等2008; Dai等2014）。然而，升高的ROS產生是否與肌肉萎縮和衰老有因果關系仍待澄清。
Nrf2是一種轉錄因子，被認為是抗氧化基因的關鍵調節因子（Motohashi和Yamamoto 2004）。響應于氧化應激，Nrf2易位到細胞核中并與其靶抗氧化基因的抗氧化反應元件結合。我們以前曾報道Nrf2缺乏會加重年輕小鼠骨骼肌中去神經支配誘導的氧化應激，而對肌肉質量的損失幾乎沒有影響（Kitaoka等，2016）。然而，據報道，Nrf2缺乏對抗氧化酶的影響在老年骨骼肌中比在幼小動物肌肉中更大（Miller等，2012）。有趣的是，Nrf2的消融導致與年齡相關的氧化應激狀態中的肌肉再生受損（Narasimhan等，2014）。為了探討Nrf2信號可能參與衰老過程，我們評估了Nrf2的缺乏是否促進骨骼肌中與年齡相關的線粒體氧化應激和肌肉萎縮。
方法
動物和實驗設計
敲除Nrf2小鼠獲自Jackson 實驗室（Bar Harbor，ME）。如先前報道的那樣通過尾部DNA的PCR分析對小鼠進行基因分型（Kitaoka等，2016）。將動物分組飼養（每籠3-4只），在空調房間中，在12小時光照，12小時黑暗環境中循環，隨意給予標準飼料和水。使用老年雄性（22個月大）Nrf2敲除小鼠和年輕（4個月大）和年齡匹配（22個月大）雄性野生型C57BL / 6J（WT）小鼠（每組n = 6-7）。通過頸脫位使動物安樂死，迅速取出肌肉，快速冷凍，并在-80℃下儲存。所有實驗均由東京大學動物實驗委員會批準。
RNA分離和實時定量PCR
在Trizol試劑（Life Technologies，Gaithersburg，MD）中將腓腸肌在冰上勻漿，然后用氯仿分離成有機相和水相。在用乙醇沉淀后，使用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen）從水相中分離總RNA。在通過分光光度法（Nanodrop ND1000，Thermo Scientific，Waltham，MA）測量RNA濃度后，使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒（Applied Biosystems，Foster City，CA）進行第一鏈cDNA合成。Nrf2，Nqo1（NAD（P）H醌氧化還原酶1），Cat（過氧化氫酶），Gclc（谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基），Sod1（超氧化物歧化酶1），Sod2，Fis1（裂變，線粒體1），Drp1的表達（啟動相關蛋白1），Mfn1（mitofusin 1），Mfn2，Opa1（視神經萎縮1）使用Thermal Cycler Dice Real-Time System和SYBR Premix Ex taq II（Takara Bio，Shiga，Japan）定量。所有樣品一式兩份進行。Tbp（TATA盒結合蛋白）用作對照基因，其表達在各組之間沒有改變。上述基因的正向和反向引物如表1所示。
線粒體分離
如前所述使用差速離心分離線粒體級分（Tamura等，2015）。簡言之，將股四頭肌肌肉在線粒體分離緩沖液（67mm蔗糖，50mm Tris，50mm KCl，10mm EDTA和0.2％（w / v）無脂肪酸的牛血清白蛋白，pH7.4）中輕度均質化。將勻漿在4℃下以700g離心15分鐘，并將上清液在12,000g下離心20分鐘。洗滌沉淀，并重懸于線粒體分離緩沖液中。在分離程序后，使用二辛可寧酸（BCA）蛋白質測定法（Pierce，Rockford，IL）定量樣品的總蛋白質含量。線粒體樣品用于分析4-HNE，蛋白質羰基，線粒體呼吸和ROS產生。我們通過蛋白質印跡使用針對甘油醛-3-磷酸脫氫酶（細胞溶質標記物）和細胞色素c氧化酶（COX）亞基IV（線粒體標記物;數據未顯示）的抗體證實了線粒體部分的純度。此外，通過在單獨的實驗中添加外源細胞色素來驗證我們的線粒體分離方法的完整性。
整個肌肉裂解物
腓腸肌在放射免疫沉淀試驗（RIPA）緩沖液（25 mmol / L Tris HCl，pH 7.6,150 mmol / L NaCl，1％NP-40，1％脫氧膽酸鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉[SDS]）中均質化，用蛋白酶抑制劑物（Complete Mini，ETDA-free，Roche Applied Science，Indianapolis，IN）和磷酸酶抑制劑（PhosSTOP，Roche Applied Science）混合。使用BCA蛋白質測定法（Pierce）定量樣品的總蛋白質含量。
蛋白質印跡
將等量的蛋白質加載到10％SDS-PAGE凝膠上并通過電泳分離。 將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白質印跡使用4-HNE（4-羥基壬烯醛; ab48506） ，Total OXPHOS Rodent WB Antibody Cocktail （ab110413），Fis1（ab96764），Drp1（ab56788），Mfn2（ab 124773） 來自美國劍橋；Opa1（#612606）來自日本東京。胭脂紅染色用于驗證一致負荷。使用C印跡掃描儀（LI-COR，Lincoln，NE）掃描并定量印跡。
蛋白質羰基含量
用市售試劑盒（＃ROIK03; SHIMA 實驗室，東京，日本）測量蛋白質羰基含量。在如上所述將線粒體蛋白轉移至PVDF膜后，使膜與二硝基苯肼（DNPH）反應，然后進行Western印跡。
酶活性
將脛骨前肌在100（v / w）的100mmol / L磷酸鉀緩沖液中勻漿。按照已建立的方案（Spinazzi等，2012），通過分光光度法測量檸檬酸合酶（CS）和COX的最大活性。如前所述（Hadwan，2018）使用分光光度法測定過氧化氫酶活性。使用Superoxide Dismutase Assay Kit（706002，Cayman，Ann Arbor，MI）按照制造商的說明測定總SOD（Mn-SOD和Cu / Zn-SOD）活性。
線粒體呼吸
將新鮮分離的線粒體（60μg）在反應緩沖液（250mmol / L蔗糖，10mmol / L Tris，1mmol / L MgCl 2）中溫育。 使用具有MitoXpress Xtra熒光傳感器試劑（Agilent Technology，Santa Clara，CA）的Tecan Spark多模板讀數器測量線粒體氧消耗，以測量溶解氧水平（Ex：380nm / Em：670nm）。通過添加10mmol / L琥珀酸鹽和1mol / L魚藤酮和2.5mmol / L ADP來刺激復合物II驅動的III期呼吸。使用操作軟件計算每分鐘的相對熒光變化。
線粒體活性氧生成
將新鮮分離的線粒體（20μg）在線粒體呼吸緩沖液和50μl/ L 2'7'-二氯熒光素（DCF）中孵育。通過添加10mmol / L琥珀酸鹽和11mol / L魚藤酮和2.5mmol / L ADP，在狀態III呼吸條件下測量ROS發射。使用Tecan多模板讀數器測量相對熒光變化（Ex：480nm / Em：520nm）。
統計分析
數據表示為平均值±標準誤差（SEM）。進行單向方差分析（ANOVA），然后進行Bonferroni多重比較試驗（GraphPad Prism 6.0，La Jolla，CA）。統計學顯著性定義為P <0.05。
結果
骨骼肌質量和肌肉減少指數
動物特征如圖1所示。老年敲除Nrf2小鼠體重比老年野生型小鼠輕（圖1A）。為了研究衰老和Nrf2缺乏對骨骼肌質量的影響，我們測量了腓腸肌和脛骨前肌的絕對質量，以及肌肉減少指數（肌肉質量/體重）。與老年野生型小鼠相比，老年敲除Nrf2小鼠的絕對肌肉質量較低（圖1B）。衰老降低肌肉減少指數，然而，Nrf2缺乏沒有影響（圖1C）。
圖1 老年敲除Nrf2小鼠的體重，骨骼肌質量和肌肉減少指數。 （A）體重。（B）腓腸肌和脛骨前肌肉質量。 （C）肌肉減少指數（每體重肌肉質量）。 數據表示為平均值±SEM。每組n = 6-7。* P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。＃P <0.05 ## P <0.01，與老年野生型相比有顯著差異。WT，野生型; KO，敲除。
圖2.老年敲除Nrf2小鼠中的Nrf2靶抗氧化基因。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。* P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。＃P <0.05 ## P <0.01，與老年野生型的差異。 WT，野生型；KO，敲除。
抗氧化基因表達和氧化應激
與野生型小鼠相比，通過不可檢測的mRNA表達證實Nrf2的敲除。衰老對Nrf2及其主要靶基因（Nqo1，Cat，Gclc，Sod1和Sod2）的mRNA表達沒有影響。Nrf2靶向抗氧化基因的表達在老年敲除Nrf2肌肉中減少，除Sod2，其他沒有改變（圖2）。為了檢測線粒體氧化損傷，我們測量了線粒體組分中4-HNE（脂質過氧化標記物）和蛋白質羰基含量（蛋白質氧化標記物）的水平。敲除Nrf2小鼠顯示4-HNE（圖3A）和蛋白質羰基含量顯著增加（圖3B）。與年輕野生型小鼠相比，敲除Nrf2小鼠的過氧化氫酶活性較低，而總SOD活性未改變（圖4）。
線粒體功能和動力學
為了檢測線粒體含量，我們首先測量了CS和COX的最大活性，代表了TCA循環和電子傳遞鏈。老年野生型和敲除Nrf2小鼠的COX活性較低，而各組間CS活性無差異（圖4）。接下來，我們測量線粒體呼吸和ROS產生作為線粒體功能的指標。隨著年齡的增長，線粒體呼吸減少，而老年敲除Nrf2小鼠的ROS產生更高（圖5A和B）。為了進一步評估線粒體質量，我們評估了線粒體動力學調節基因的表達。老年肌肉中Drp1 mRNA較高，而老年敲除Nrf2小鼠中Mfn1和Mfn2 mRNA較低（圖6）。在蛋白質水平，敲除Nrf2導致線粒體復合物I和II減少，而III，IV和V保持不變（圖7A）。雖然Mfn2蛋白含量的下降接近顯著性（P = 0.10），但Nrf2缺乏對線粒體融合和裂變蛋白沒有影響（圖7B）。
圖3.老年敲除Nrf2小鼠的線粒體氧化應激。 A）線粒體4-HNE含量。 B）線粒體蛋白質羰基。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年野生型的差異。WT，野生型；KO，淘汰賽
圖4.老年敲除Nrf2小鼠中的酶活性。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
圖5.老年敲除Nrf2小鼠的線粒體功能。 A）線粒體呼吸期間的耗氧率。 B）每消耗氧氣的線粒體ROS產生。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年野生型的差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
圖6.老年敲除Nrf2小鼠中的線粒體動力學基因。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05，與年輕野生型有顯著差異。 ## P <0.01，與老年野生型的差異。WT，野生型；KO，淘汰賽。
圖7.來自老年敲除Nrf2小鼠的全肌裂解物中的線粒體蛋白水平。 A）線粒體OXPHOS蛋白。 B）線粒體融合和裂變調節蛋白。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05，與WTYOUNG有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年的差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
討論
盡管線粒體被認為是肌肉減少癥的主要潛在介質，但骨骼肌線粒體與肌肉減少癥之間關系的分子基礎仍不清楚。衰老對線粒體含量的影響的假設一直存在爭議；然而，大多數報告顯示隨著衰老而ROS產生增加（Carter等2015; Holloway等2018）。鑒于線粒體不僅是ROS的主要來源，而且也是氧化損傷的目標，ROS可能會產生反饋環，從而加劇線粒體功能障礙。以前的研究調查了Nrf2與線粒體功能之間的關系（Holmstrom等，2013; Coleman等，2018）。 Nrf2的缺失導致小鼠胚胎成纖維細胞（Holmstrom等2013）或UCP1轉基因小鼠的肌纖維中的線粒體呼吸受損（Coleman等，2018）；然而，據我們所知，尚未檢查來自老年敲除Nrf2 骨骼肌的分離的線粒體組分。在這項研究中，我們發現從老化敲除Nrf2的肌肉中分離的線粒體部分中的氧化應激顯著增加。如早期研究中所觀察到的，Nrf2缺乏誘導其靶抗氧化基因表達的降低（Miller等，2012; Kitaoka等，2016）。重要的是，先前的研究證實了老年敲除Nrf2小鼠的整個肌肉勻漿中ROS和4-HNE水平的增加（Miller等，2012; Narasimhan等，2014）。目前使用分離的線粒體組分的研究表明氧化還原平衡被改變為氧化應激的積累，氧化應激被認為是線粒體毒性的指標。然而，盡管線粒體氧化應激升高，但Nrf2缺乏對老年骨骼肌中線粒體呼吸和肌肉減少指數沒有影響。最后，我們評估了與線粒體融合和裂變相關的基因的mRNA和蛋白質表達，這是維持功能性線粒體的重要過程（Yan等，2012）。形態學上，衰老誘導骨骼肌中的線粒體斷裂或異常增大（Iqbal等2013; Leduc-Gaudet等2015）。我們觀察到線粒體融合調節基因在老年Nrf2肌肉中適度下調，支持ROS誘導線粒體斷裂的概念（Fan等，2010; Iqbal和Hood，2014）。然而，在蛋白質水平，Mfn2與Nrf2 KO的下降沒有達到顯著性。需要進一步研究通過電子顯微鏡以檢查老年敲除Nrf2肌肉中的線粒體是否顯示異常超微結構?？傊?，我們的研究結果表明，氧化應激不是肌肉萎縮的直接原因。我們的數據與先前使用敲除Nrf2小鼠在去神經支配誘導的肌肉萎縮（Kitaoka等2016）和鏈脲佐菌素誘導的糖尿病萎縮模型（Whitman等2013）中的觀察一致。
使用具有遺傳增強的線粒體抗氧化活性的小鼠（Umanskaya等，2014）或用線粒體保護性肽治療的小鼠（Siegel等，2013）的證據證明支持線粒體氧化損傷在年齡相關的肌肉功能障礙中的作用。此外，稱為Nrf2激活劑的蘿卜硫素的使用已經顯示出在小鼠肌營養不良模型中改善的肌肉功能（Sun等，2015）。這項研究的局限性在于我們沒有測量骨骼肌纖維的大小/數量和收縮功能。 Crilly等（2016）報道，與野生型動物相比，敲除Nrf2小鼠在分離的肌肉中表現出更高的疲勞率。最近，Ahn等（2018）報道，與年齡匹配的野生型小鼠相比，在老年敲除Nrf2小鼠中，肌肉橫截面積歸一化的力產生減少。這些研究表明，由于缺乏Nrf2，高水平的ROS暴露可能改變肌肉收縮功能，不一定伴隨肌肉質量的變化。
在這項研究中，我們試圖檢查Nrf2缺乏對老年骨骼肌線粒體的影響。我們證明Nrf2缺乏增強了老年骨骼肌中線粒體ROS的產生，并加劇了與年齡相關的氧化應激，但對線粒體功能或肌肉質量幾乎沒有影響。
利益沖突
沒有利益沖突。
參考文獻（略）
翻譯：
Nrf2缺乏對老年骨骼肌線粒體氧化應激的影響
Yu Kitaoka 1 , Yuki Tamura 2 , Kenya Takahashi 3 , Kohei Takeda 4 , Tohru Takemasa 4 & Hideo Hatta3
1日本橫濱神奈川大學人文科學系Yu Kitaoka 1 , Yuki Tamura 2 , Kenya Takahashi 3 , Kohei Takeda 4 , Tohru Takemasa 4 & Hideo Hatta3
2日本東京日本體育科學大學運動生理學系
3日本東京大學體育科學系
4日本筑波大學綜合人類科學研究科
關鍵詞 衰老，線粒體，氧化應激，骨骼肌肉
摘要 氧化應激和線粒體功能障礙與衰老過程有關。然而，核因子紅細胞系2相關因子2（Nrf2）在衰老過程中對骨骼肌的作用仍有待闡明。在目前的研究中，我們評估了缺乏Nrf2，它被稱為氧化還原穩態的主要調節因子，是否會促進骨骼肌中與年齡相關的線粒體功能障礙和肌肉萎縮。在這里，我們揭示了在老年Nrf2敲除的（KO）小鼠中，由于Nrf2-靶向抗氧化基因的表達降低，線粒體中氧化應激的標志物4-羥基壬烯醛和蛋白質羰基強烈升高。線粒體呼吸隨著衰老而下降，然而，敲除Nrf2 和年齡匹配的野生型小鼠之間沒有差異。類似地，與年輕野生型小鼠相比，老年野生型和敲除Nrf2 小鼠中的細胞色素c氧化酶活性較低。老年敲除Nrf2 小鼠肌肉中Mfn1和Mfn2 mRNA的表達較低。在老化的敲除Nrf2小鼠中，每消耗氧氣的線粒體活性氧產生增加。敲除Nrf2 對體重歸一化的肌肉質量沒有影響。這些結果表明，Nrf2缺乏會加劇與年齡相關的線粒體氧化應激，但不會影響骨骼肌呼吸功能的下降。
引言
衰老的特征在于骨骼肌質量和功能的喪失，這種現象稱為肌肉減少癥。這種肌肉功能的喪失導致身體虛弱和死亡的風險增加（Cruz-Jentoft等，2010）。因此，了解肌肉萎縮隨老化的機制對于識別治療目標和促進健康非常重要。衰老過程被認為是由氧化應激驅動的，最初由Harman 于1956年提出作為自由基理論。鑒于線粒體電子傳遞鏈是活性氧（ROS）的主要來源，線粒體被認為在肌肉減少癥中起著至關重要的作用。與該假設一致，許多研究表明老年骨骼肌中ROS產生增加，與線粒體功能障礙和線粒體細胞凋亡易感性增加相關（Chabi等2008; Dai等2014）。然而，升高的ROS產生是否與肌肉萎縮和衰老有因果關系仍待澄清。
Nrf2是一種轉錄因子，被認為是抗氧化基因的關鍵調節因子（Motohashi和Yamamoto 2004）。響應于氧化應激，Nrf2易位到細胞核中并與其靶抗氧化基因的抗氧化反應元件結合。我們以前曾報道Nrf2缺乏會加重年輕小鼠骨骼肌中去神經支配誘導的氧化應激，而對肌肉質量的損失幾乎沒有影響（Kitaoka等，2016）。然而，據報道，Nrf2缺乏對抗氧化酶的影響在老年骨骼肌中比在幼小動物肌肉中更大（Miller等，2012）。有趣的是，Nrf2的消融導致與年齡相關的氧化應激狀態中的肌肉再生受損（Narasimhan等，2014）。為了探討Nrf2信號可能參與衰老過程，我們評估了Nrf2的缺乏是否促進骨骼肌中與年齡相關的線粒體氧化應激和肌肉萎縮。
方法
動物和實驗設計
敲除Nrf2小鼠獲自Jackson 實驗室（Bar Harbor，ME）。如先前報道的那樣通過尾部DNA的PCR分析對小鼠進行基因分型（Kitaoka等，2016）。將動物分組飼養（每籠3-4只），在空調房間中，在12小時光照，12小時黑暗環境中循環，隨意給予標準飼料和水。使用老年雄性（22個月大）Nrf2敲除小鼠和年輕（4個月大）和年齡匹配（22個月大）雄性野生型C57BL / 6J（WT）小鼠（每組n = 6-7）。通過頸脫位使動物安樂死，迅速取出肌肉，快速冷凍，并在-80℃下儲存。所有實驗均由東京大學動物實驗委員會批準。
RNA分離和實時定量PCR
在Trizol試劑（Life Technologies，Gaithersburg，MD）中將腓腸肌在冰上勻漿，然后用氯仿分離成有機相和水相。在用乙醇沉淀后，使用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen）從水相中分離總RNA。在通過分光光度法（Nanodrop ND1000，Thermo Scientific，Waltham，MA）測量RNA濃度后，使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒（Applied Biosystems，Foster City，CA）進行第一鏈cDNA合成。Nrf2，Nqo1（NAD（P）H醌氧化還原酶1），Cat（過氧化氫酶），Gclc（谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基），Sod1（超氧化物歧化酶1），Sod2，Fis1（裂變，線粒體1），Drp1的表達（啟動相關蛋白1），Mfn1（mitofusin 1），Mfn2，Opa1（視神經萎縮1）使用Thermal Cycler Dice Real-Time System和SYBR Premix Ex taq II（Takara Bio，Shiga，Japan）定量。所有樣品一式兩份進行。Tbp（TATA盒結合蛋白）用作對照基因，其表達在各組之間沒有改變。上述基因的正向和反向引物如表1所示。
線粒體分離
如前所述使用差速離心分離線粒體級分（Tamura等，2015）。簡言之，將股四頭肌肌肉在線粒體分離緩沖液（67mm蔗糖，50mm Tris，50mm KCl，10mm EDTA和0.2％（w / v）無脂肪酸的牛血清白蛋白，pH7.4）中輕度均質化。將勻漿在4℃下以700g離心15分鐘，并將上清液在12,000g下離心20分鐘。洗滌沉淀，并重懸于線粒體分離緩沖液中。在分離程序后，使用二辛可寧酸（BCA）蛋白質測定法（Pierce，Rockford，IL）定量樣品的總蛋白質含量。線粒體樣品用于分析4-HNE，蛋白質羰基，線粒體呼吸和ROS產生。我們通過蛋白質印跡使用針對甘油醛-3-磷酸脫氫酶（細胞溶質標記物）和細胞色素c氧化酶（COX）亞基IV（線粒體標記物;數據未顯示）的抗體證實了線粒體部分的純度。此外，通過在單獨的實驗中添加外源細胞色素來驗證我們的線粒體分離方法的完整性。
整個肌肉裂解物
腓腸肌在放射免疫沉淀試驗（RIPA）緩沖液（25 mmol / L Tris HCl，pH 7.6,150 mmol / L NaCl，1％NP-40，1％脫氧膽酸鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉[SDS]）中均質化，用蛋白酶抑制劑物（Complete Mini，ETDA-free，Roche Applied Science，Indianapolis，IN）和磷酸酶抑制劑（PhosSTOP，Roche Applied Science）混合。使用BCA蛋白質測定法（Pierce）定量樣品的總蛋白質含量。
蛋白質印跡
將等量的蛋白質加載到10％SDS-PAGE凝膠上并通過電泳分離。 將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白質印跡使用4-HNE（4-羥基壬烯醛; ab48506） ，Total OXPHOS Rodent WB Antibody Cocktail （ab110413），Fis1（ab96764），Drp1（ab56788），Mfn2（ab 124773） 來自美國劍橋；Opa1（#612606）來自日本東京。胭脂紅染色用于驗證一致負荷。使用C印跡掃描儀（LI-COR，Lincoln，NE）掃描并定量印跡。
蛋白質羰基含量
用市售試劑盒（＃ROIK03; SHIMA 實驗室，東京，日本）測量蛋白質羰基含量。在如上所述將線粒體蛋白轉移至PVDF膜后，使膜與二硝基苯肼（DNPH）反應，然后進行Western印跡。
酶活性
將脛骨前肌在100（v / w）的100mmol / L磷酸鉀緩沖液中勻漿。按照已建立的方案（Spinazzi等，2012），通過分光光度法測量檸檬酸合酶（CS）和COX的最大活性。如前所述（Hadwan，2018）使用分光光度法測定過氧化氫酶活性。使用Superoxide Dismutase Assay Kit（706002，Cayman，Ann Arbor，MI）按照制造商的說明測定總SOD（Mn-SOD和Cu / Zn-SOD）活性。
線粒體呼吸
將新鮮分離的線粒體（60μg）在反應緩沖液（250mmol / L蔗糖，10mmol / L Tris，1mmol / L MgCl 2）中溫育。 使用具有MitoXpress Xtra熒光傳感器試劑（Agilent Technology，Santa Clara，CA）的Tecan Spark多模板讀數器測量線粒體氧消耗，以測量溶解氧水平（Ex：380nm / Em：670nm）。通過添加10mmol / L琥珀酸鹽和1mol / L魚藤酮和2.5mmol / L ADP來刺激復合物II驅動的III期呼吸。使用操作軟件計算每分鐘的相對熒光變化。
線粒體活性氧生成
將新鮮分離的線粒體（20μg）在線粒體呼吸緩沖液和50μl/ L 2'7'-二氯熒光素（DCF）中孵育。通過添加10mmol / L琥珀酸鹽和11mol / L魚藤酮和2.5mmol / L ADP，在狀態III呼吸條件下測量ROS發射。使用Tecan多模板讀數器測量相對熒光變化（Ex：480nm / Em：520nm）。
統計分析
數據表示為平均值±標準誤差（SEM）。進行單向方差分析（ANOVA），然后進行Bonferroni多重比較試驗（GraphPad Prism 6.0，La Jolla，CA）。統計學顯著性定義為P <0.05。
結果
骨骼肌質量和肌肉減少指數
動物特征如圖1所示。老年敲除Nrf2小鼠體重比老年野生型小鼠輕（圖1A）。為了研究衰老和Nrf2缺乏對骨骼肌質量的影響，我們測量了腓腸肌和脛骨前肌的絕對質量，以及肌肉減少指數（肌肉質量/體重）。與老年野生型小鼠相比，老年敲除Nrf2小鼠的絕對肌肉質量較低（圖1B）。衰老降低肌肉減少指數，然而，Nrf2缺乏沒有影響（圖1C）。
圖1 老年敲除Nrf2小鼠的體重，骨骼肌質量和肌肉減少指數。 （A）體重。（B）腓腸肌和脛骨前肌肉質量。 （C）肌肉減少指數（每體重肌肉質量）。 數據表示為平均值±SEM。每組n = 6-7。* P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。＃P <0.05 ## P <0.01，與老年野生型相比有顯著差異。WT，野生型; KO，敲除。
圖2.老年敲除Nrf2小鼠中的Nrf2靶抗氧化基因。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。* P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。＃P <0.05 ## P <0.01，與老年野生型的差異。 WT，野生型；KO，敲除。
抗氧化基因表達和氧化應激
與野生型小鼠相比，通過不可檢測的mRNA表達證實Nrf2的敲除。衰老對Nrf2及其主要靶基因（Nqo1，Cat，Gclc，Sod1和Sod2）的mRNA表達沒有影響。Nrf2靶向抗氧化基因的表達在老年敲除Nrf2肌肉中減少，除Sod2，其他沒有改變（圖2）。為了檢測線粒體氧化損傷，我們測量了線粒體組分中4-HNE（脂質過氧化標記物）和蛋白質羰基含量（蛋白質氧化標記物）的水平。敲除Nrf2小鼠顯示4-HNE（圖3A）和蛋白質羰基含量顯著增加（圖3B）。與年輕野生型小鼠相比，敲除Nrf2小鼠的過氧化氫酶活性較低，而總SOD活性未改變（圖4）。
線粒體功能和動力學
為了檢測線粒體含量，我們首先測量了CS和COX的最大活性，代表了TCA循環和電子傳遞鏈。老年野生型和敲除Nrf2小鼠的COX活性較低，而各組間CS活性無差異（圖4）。接下來，我們測量線粒體呼吸和ROS產生作為線粒體功能的指標。隨著年齡的增長，線粒體呼吸減少，而老年敲除Nrf2小鼠的ROS產生更高（圖5A和B）。為了進一步評估線粒體質量，我們評估了線粒體動力學調節基因的表達。老年肌肉中Drp1 mRNA較高，而老年敲除Nrf2小鼠中Mfn1和Mfn2 mRNA較低（圖6）。在蛋白質水平，敲除Nrf2導致線粒體復合物I和II減少，而III，IV和V保持不變（圖7A）。雖然Mfn2蛋白含量的下降接近顯著性（P = 0.10），但Nrf2缺乏對線粒體融合和裂變蛋白沒有影響（圖7B）。
圖3.老年敲除Nrf2小鼠的線粒體氧化應激。 A）線粒體4-HNE含量。 B）線粒體蛋白質羰基。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年野生型的差異。WT，野生型；KO，淘汰賽
圖4.老年敲除Nrf2小鼠中的酶活性。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
圖5.老年敲除Nrf2小鼠的線粒體功能。 A）線粒體呼吸期間的耗氧率。 B）每消耗氧氣的線粒體ROS產生。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05 ** P <0.01，與年輕野生型有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年野生型的差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
圖6.老年敲除Nrf2小鼠中的線粒體動力學基因。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05，與年輕野生型有顯著差異。 ## P <0.01，與老年野生型的差異。WT，野生型；KO，淘汰賽。
圖7.來自老年敲除Nrf2小鼠的全肌裂解物中的線粒體蛋白水平。 A）線粒體OXPHOS蛋白。 B）線粒體融合和裂變調節蛋白。 數據表示為平均值±每組SEM n = 5-7。 * P <0.05，與WTYOUNG有顯著差異。 ＃P <0.05，與老年的差異。 WT，野生型; KO，淘汰賽。
討論
盡管線粒體被認為是肌肉減少癥的主要潛在介質，但骨骼肌線粒體與肌肉減少癥之間關系的分子基礎仍不清楚。衰老對線粒體含量的影響的假設一直存在爭議；然而，大多數報告顯示隨著衰老而ROS產生增加（Carter等2015; Holloway等2018）。鑒于線粒體不僅是ROS的主要來源，而且也是氧化損傷的目標，ROS可能會產生反饋環，從而加劇線粒體功能障礙。以前的研究調查了Nrf2與線粒體功能之間的關系（Holmstrom等，2013; Coleman等，2018）。 Nrf2的缺失導致小鼠胚胎成纖維細胞（Holmstrom等2013）或UCP1轉基因小鼠的肌纖維中的線粒體呼吸受損（Coleman等，2018）；然而，據我們所知，尚未檢查來自老年敲除Nrf2 骨骼肌的分離的線粒體組分。在這項研究中，我們發現從老化敲除Nrf2的肌肉中分離的線粒體部分中的氧化應激顯著增加。如早期研究中所觀察到的，Nrf2缺乏誘導其靶抗氧化基因表達的降低（Miller等，2012; Kitaoka等，2016）。重要的是，先前的研究證實了老年敲除Nrf2小鼠的整個肌肉勻漿中ROS和4-HNE水平的增加（Miller等，2012; Narasimhan等，2014）。目前使用分離的線粒體組分的研究表明氧化還原平衡被改變為氧化應激的積累，氧化應激被認為是線粒體毒性的指標。然而，盡管線粒體氧化應激升高，但Nrf2缺乏對老年骨骼肌中線粒體呼吸和肌肉減少指數沒有影響。最后，我們評估了與線粒體融合和裂變相關的基因的mRNA和蛋白質表達，這是維持功能性線粒體的重要過程（Yan等，2012）。形態學上，衰老誘導骨骼肌中的線粒體斷裂或異常增大（Iqbal等2013; Leduc-Gaudet等2015）。我們觀察到線粒體融合調節基因在老年Nrf2肌肉中適度下調，支持ROS誘導線粒體斷裂的概念（Fan等，2010; Iqbal和Hood，2014）。然而，在蛋白質水平，Mfn2與Nrf2 KO的下降沒有達到顯著性。需要進一步研究通過電子顯微鏡以檢查老年敲除Nrf2肌肉中的線粒體是否顯示異常超微結構?？傊?，我們的研究結果表明，氧化應激不是肌肉萎縮的直接原因。我們的數據與先前使用敲除Nrf2小鼠在去神經支配誘導的肌肉萎縮（Kitaoka等2016）和鏈脲佐菌素誘導的糖尿病萎縮模型（Whitman等2013）中的觀察一致。
使用具有遺傳增強的線粒體抗氧化活性的小鼠（Umanskaya等，2014）或用線粒體保護性肽治療的小鼠（Siegel等，2013）的證據證明支持線粒體氧化損傷在年齡相關的肌肉功能障礙中的作用。此外，稱為Nrf2激活劑的蘿卜硫素的使用已經顯示出在小鼠肌營養不良模型中改善的肌肉功能（Sun等，2015）。這項研究的局限性在于我們沒有測量骨骼肌纖維的大小/數量和收縮功能。 Crilly等（2016）報道，與野生型動物相比，敲除Nrf2小鼠在分離的肌肉中表現出更高的疲勞率。最近，Ahn等（2018）報道，與年齡匹配的野生型小鼠相比，在老年敲除Nrf2小鼠中，肌肉橫截面積歸一化的力產生減少。這些研究表明，由于缺乏Nrf2，高水平的ROS暴露可能改變肌肉收縮功能，不一定伴隨肌肉質量的變化。
在這項研究中，我們試圖檢查Nrf2缺乏對老年骨骼肌線粒體的影響。我們證明Nrf2缺乏增強了老年骨骼肌中線粒體ROS的產生，并加劇了與年齡相關的氧化應激，但對線粒體功能或肌肉質量幾乎沒有影響。
利益沖突
沒有利益沖突。
參考文獻（略）
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