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Nrf2介導運動誘導的小鼠中線粒體生物發生和抗氧化反應
發表于：2020-06-01 作者：admin 來源：本站 點擊量：7769
Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2 (NFE2L2, Nrf2) mediates exercise-induced mitochondrial biogenesis and the anti-oxidant response in mice
Nrf2介導運動誘導的小鼠中線粒體生物發生和抗氧化反應
Merry T L , Ristow M . Journal of Physiology, 2016, 594(18):5195.
Nrf2介導運動誘導的小鼠中線粒體生物發生和抗氧化反應
Merry T L , Ristow M . Journal of Physiology, 2016, 594(18):5195.
關鍵點
·活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）調節運動誘導的核因子紅細胞2相關因子2（NFE2L2，Nrf2）在骨骼肌中的表達。
·NFE2L2（Nrf2）是急性運動誘導的骨骼肌線粒體生物發生基因增加所必需的，這些基因有：如核呼吸因子1（NRF-1）和線粒體轉錄因子A，以及抗氧化基因，如超氧化物歧化酶（SOD）1，SOD2和過氧化氫酶。
·NFE2L2(Nrf2)表達受損的小鼠運動訓練后的運動表現、能量消耗、線粒體體積和抗氧化活性都會降低。
·在肌肉細胞中，ROS和NO可通過NFE2L2(Nrf2) / NRF-1依賴性途徑調節線粒體生物發生。
摘要
有規律的運動可以誘導骨骼肌的適應性，包括線粒體的生物發生和增強抗氧化儲備。這些適應和其他因素至少在一定程度上是身體活動個體健康狀況改善的原因?；顒悠陂g產生活性氧（ROS）和一氧化氮（NO），可能介導對骨骼肌運動的適應性反應。然而，它們的作用機制尚不清楚。在本研究中，我們旨在確定氧化還原敏感轉錄因子核因子紅細胞衍生2樣2（NFE2L2/ Nrf2）在急性運動和訓練誘導的線粒體生物發生和抗氧化反應中的作用。我們報道ROS和NO調節小鼠骨骼肌和肌肉細胞中急性運動誘導的NFE2L2(Nrf2)表達，并且NFE2L2的缺乏阻止了正常急性跑步機運動誘導的線粒體生物發生標志物mRNA的增加，如核呼吸因子1（NRF-1）和小鼠腓腸肌中的線粒體轉錄因子A（mtTFA）和抗氧化劑超氧化物歧化酶（SOD）1和2，以及過氧化氫酶。此外，經過5周的跑步機運動訓練后，與野生型同窩仔相比，缺乏NFE2L2的小鼠運動能力和全身能量消耗以及骨骼肌線粒體質量和SOD活性均降低。在C2C12成肌細胞中，外源性H2O2（ROS）和二乙烯三胺/ NO加合物（NO供體）的急性處理誘導了mtTFA的增加，這通過小干擾RNA和NFE2L2或NRF-1的短發夾RNA敲低來阻止。我們的研究結果表明，在運動過程中，ROS和NO可通過NFE2L2發揮作用，在功能上調節骨骼肌線粒體生物合成和抗氧化防御基因的表達。
縮寫： AICAR，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸; AMPK，5腺苷單磷酸激活的蛋白激酶; COX4，細胞色素c氧化酶亞基4; Deta / NO，二亞乙基三胺/一氧化氮加合物; GSH，還原型谷胱甘肽; GSR，谷胱甘肽還原酶; GSSG，氧化型谷胱甘肽; GST，谷胱甘肽S-轉移酶; H2O2，過氧化氫; KO，敲除; L-NAME，NG-硝基-L-精氨酸; MAPK，絲裂原活化蛋白激酶; mtTFA，線粒體轉錄因子A; NAC，N-乙酰半胱氨酸; NFE2L2/Nrf2，核因子紅細胞2相關因子2; NF-κB，活化B細胞核因子κ-輕鏈增強子; NO，一氧化氮; NRF，核呼吸因子; PGC1α，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α; ROS，活性氧; shRNA，短發夾RNA; siRNA，小干擾RNA; SOD，超氧化物歧化酶; WT，野生型。
1. 引言
有規律的定期運動可以降低疾病發生率并延長預期壽命（Warburton等，2006）。骨骼肌對急性運動應激特別敏感，運動訓練引起適應性變化，如抗氧化能力、線粒體體積和胰島素信號中間體的增加，這改善肌肉功能，防止發育代謝紊亂（Egan＆Zierath，2013）。運動可促進骨骼肌適應性變化的機制之一是通過急劇升高氧化應激和亞硝化應激來實現（Gomez-Cabrera等，2015）。
在運動或收縮過程中，骨骼肌產生活性氧(ROS)和一氧化氮(NO) (Powers & Jackson, 2008)。NO和ROS均可促進線粒體生物合成（Suzuki等，1998; Nisoli等，2003; Piantadosi＆Suliman，2006）。在一些研究中，已經顯示通過補充抗氧化劑來預防運動期間ROS的增加來減弱急性運動和運動訓練誘導線粒體生物發生標志物和抗氧化劑反應的增加（Gomez-Cabrera等人2005; Gomez-Cabrera等人2008; Ristow等人2009; Strobel等人2011; Wadley等人2013; Paulsen等人，2014a），但在其他研究中沒有這樣的發現（Yfanti等人2010; Higashida等人2011; Wadley等人2013）。然而，ROS和NO協調運動應激適應性反應的機制尚不清楚。
轉錄因子過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子1α（PGC1α）被視為運動誘導的線粒體生物發生和抗氧化反應的主要調節因子（Lin等人，2005）。PGC1α在運動后增加，并共激活核呼吸因子NRF-1和NRF-2，其激活線粒體轉錄因子A（mtTFA）以促進線粒體復制（Bassel-Duby＆Olson，2006）。實際上，NO和ROS可以增加骨骼肌中PGC1α，NRF1和mtTFA的表達，并且抗氧化劑補充可以減少運動誘導的PGC1α水平的增加（Nisoli等人2003; Gomez-Cabrera等人2005; Ristow等人，2009）。這些觀察結果表明ROS通過PGC1α起作用以調節骨骼肌中運動誘導的適應性反應。然而，PGC1α不是正常運動誘導的線粒體生物發生和抗氧化劑表達標志物增加所必需的（Leick等人，2008），表明替代機制也參與調節骨骼肌適應運動。
核因子紅細胞衍生2樣2（NFE2L2;也經常稱為Nrf2）是ROS和NO敏感的轉錄因子（Kensler等人，2007）。細胞暴露于氧化應激或亞硝化應激導致NFE2L2從細胞質（在細胞質中NFE2L2被Keap1錨定來降解）轉移到細胞核，在細胞核中它與抗氧化反應元件結合以啟動保護細胞免受細胞毒性和氧化損傷的防御（Kensler等，2007）。NFE2L2的主要功能是協調抗氧化劑對應激的反應，因此，NFE2L2切除可以防止在最后一次非常激烈的短期跑步訓練（2周）后，老年（> 23個月）小鼠骨骼肌抗氧化基因mRNA水平的立即增加 （Narasimhan等，2014）。此外，NFE2L2是心肌中一氧化碳應激（Piantadosi等人，2008）和肝臟炎癥（Piantadosi等人，2011）誘導的線粒體生物發生所必需的。
因為NFE2L2可以調節線粒體生物發生和對急性氧化和亞硝化應激的抗氧化反應，我們確定骨骼肌NFE2L2是否被急性運動激活以及NFE2L2是否調節急性和運動訓練誘導的線粒體生物發生和抗氧化劑響應的增加。我們報道NO和ROS均有助于在急性運動后增加骨骼肌NFE2L2的mRNA，并且NFE2L2表達是線粒體生物發生標志物正常增加和急性運動以及運動訓練后骨骼肌抗氧化反應所必需的。此外，我們的數據表明，ROS（H2O2）和NO誘導的線粒體生物發生標記物（mRNA）的增加依賴于NFE2L2和NRF1，而只有NO介導的線粒體生物發生基因表達需要PGC1α。
2. 方法
2.1 動物倫理
本研究中描述的所有程序均經瑞士蘇黎世獸醫辦公室（許可證號ZH245 / 14）批準，并按照蘇黎世聯邦理工學院和瑞士國家動物福利指南進行。研究人員了解生理學期刊運作的倫理原則，這項工作符合動物倫理檢查表。
2.2 小鼠繁殖和住房條件
小鼠被養在一個溫度控制的設施中，保持12:12小時的光/暗循環，并且可以隨意食用不含維生素E、C（S8022-S005；SSNIFF Spezialdiaten GmbH，Soest，Germany）和水的飲食。先前已經描述了NFE2L2-/-（也稱為Nrf2-/-）小鼠（Chan等人，1994），是購于Jackson 實驗室（Bar Harbor，ME，USA）并在C57Bl / 6背景下內部繁殖。雄性（約25-30g，15-30周齡）NFE2L2-/-小鼠和NEF2L2 + / +同窩小鼠，分別稱為NFE2L2敲除（KO）和野生型（WT），并且C57Bl / 6小鼠應用于所有的實驗。所有小鼠均經頸椎脫位人工處死。
2.3 運動協議和代謝籠
所有運動小鼠在初始運動試驗前5天以上分別接受至少兩次跑步機（Panlab/Harvard Instrument，Holliston，MA，USA）熟悉訓練。熟悉訓練包括以0-9 米/ 粉種的速度于跑步機跑步5分鐘，傾斜角度為0°。通過位于跑步機帶末端的沖擊網格提供溫和的電刺激作為動力。有氧能力是通過增量跑步機測試至力竭來測定的。將跑步機設定為10°傾斜，并且每2分鐘將速度增加2米/分鐘，直到小鼠在不嘗試繼續跑步的情況下在沖擊網格上度過>5秒。為了測試耐力能力，將跑步機設定為傾斜15°，并且起始速度為5米/分鐘，其以0.17米/分鐘的速率連續增加（傾斜），直到小鼠在不嘗試繼續跑步的情況下在沖擊網格上度過>5秒。
運動訓練包括30-60分鐘的跑步機運動，以10-15米/分鐘的速度運行，10°傾斜，4-5天/周，持續4-6周。急性運動方案包括1小時的跑步機運動訓練，以12米/分鐘的速度運行，傾斜10°。在指定的時間點進行急性運動后，以及在運動訓練小鼠的最后一次運動至少36小時后，收集組織并在液氮中快速冷凍。
在24-48小時的適應期后，使用PhenoMaster（TSE 系統，Bad Homburg，Germany）開路量熱系統測量超過48小時（兩個光/暗循環）的耗氧量和動態活動。
2.4 抗體和試劑
兔NFE2L2抗體購自Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, 美國)， NRF-1購自Cell Signaling Technology (Beverly, MA, 美國)。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）購自Adipogen AG（Liestal，瑞士）。除非另有說明，否則所有其他試劑均購自Sigma-Aldrich Chemicals（St Louis，MO，美國）。
2.5 N -乙酰半胱氨酸(NAC)和L-NG-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)處理小鼠
對于涉及抑制NO合酶和清除ROS小鼠的實驗，實驗前3天在小鼠飲用水中分別加入L-NAME（1 g/l）（Wadley＆McConell，2007）或NAC（10 g/l）（Chen等人，2010）（Cobley等,2015）。
2.6 實時PCR
使用Trizol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國）從細胞或冷凍肌肉樣品中提取RNA，并使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，美國）逆轉錄mRNA。為了定量mtDNA，通過標準蛋白酶K和苯酚 - 氯仿提取分離總DNA。使用SYBR green select master mix試劑盒（Applied Biosystems）在ViiATM 7實時PCR系統（Applied Biosystems）上進行定量實時PCR。反應一式三份進行，并使用ΔΔCt方法以18S核糖體RNA作為內部對照實現相對定量。使用的引物序列列于表1中。
表1. 小鼠定量PCR引物序列
2.7 細胞培養
C2C12成肌細胞在含有5.5mM D-葡萄糖和20％胎牛血清的DME培養基中于37℃在5％CO2比21％O2中生長。通過在抗生素選擇（10天，1μg/ ml 嘌呤霉素）之前使用脂質體(Lipofectamine)2000（Invitrogen）轉染合并的shRNA克?。═RCN0000012128，TRCN0000012129，TRCN00000121; Broad Institute RNAi consortium，Cambridge，MA，美國）來實現NFE2L2的短發夾RNA（shRNA）敲低。通過使用Lipofectamine 2000用指定濃度的相應特異性小干擾RNA（siRNA）（Santa Cruz Biotechnology）轉染來實現NRF-1和PGC1α基因表達的瞬時敲低，并在轉染后24小時收集細胞。用AICAR（1mM），二亞乙基三胺/一氧化氮加合物（Deta / NO）（100μM）或H2O2（5μM）對C2C12細胞進行長時間的間歇處理，包括將化合物施加5小時/天，持續5天。劑量和治療時間基于先前研究中研究永生化肌肉細胞中線粒體生物發生的濃度（McConnell等人2010年；Lira等人2010a），以及初步研究，這些研究獲得了在不導致任何細胞死亡的情況下提高NFE2l2表達所需的最佳劑量（數據未顯示）。
2.8 免疫印跡
基本上如先前所述（Merry等人，2014）進行免疫印跡操作。簡而言之，將細胞從培養皿中分離出來，或者用電動手持勻漿機將冰凍的小鼠組織樣本勻漿到10-20體積的RIPA冰裂解緩沖液中（50mM Hepes，pH 7.4,1％，v / v Triton X-100，1％v / v脫氧膽酸鈉，0.1％v / v SDS，150mM NaCl，10％v / v甘油，1.5mM MgCl2, 1mM EGTA，50mM氟化鈉，蛋白質抑制劑混合物（羅氏，巴塞爾，瑞士），1mM苯基甲基磺酰氟，1mM釩酸鈉），在冰上孵育20分鐘，并在4℃下以20,000g離心60分鐘。通過SDS-PAGE分離上清液，并通過標準程序進行免疫印跡處理。
2.9 SOD和檸檬酸合酶活性測定
將冷凍肌肉與50mm磷酸鹽緩沖液+1mMEDTA一起置于氮氣冷凍砂漿中研磨，并進行超聲處理。裂解液在12,000 g和4℃下離心15分鐘。如上所述，將上清液用于隨后的超氧化物歧化酶測量（Weimeret al.2014）。通過檢測在412nm波長下5,5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸酯的增加，在上清液中測量檸檬酸合酶活性（Srere，1969）。
2.10 谷胱甘肽和蛋白質羰基化
使用BIOXYTECH GSH / GSSG-412測定試劑盒（Oxis International，Inc.，Tampa，FL，USA）測量全血中總的谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽水平，并根據制造商的說明書測定GSH：GSSG比率。根據制造商的說明書使用OxyBlot蛋白質氧化檢測試劑盒（Merck Millipore，Billerica，MA，USA）監測蛋白質羰基化。
2.11 統計分析
所有數據均以平均值±SEM表示。使用非配對雙尾Student’s t 檢驗和單向、雙向ANOVA來確定統計學顯著性，所述ANOVA具有所示的Fisher最不顯著差異事后歸因分析。P <0.05被認為具有統計學意義。
3. 結果
3.1 通過運動增加骨骼肌NFE2L2的表達
運動增加骨骼肌產生ROS和NO (Powers & Jackson, 2008)，轉錄因子NFE2L2對細胞ROS和NO水平的變化敏感(Kensler等，2007)。因此，我們首先確定運動是否調節NFE2L2在小鼠骨骼肌中的表達。急性跑步機運動30分鐘后，骨骼肌NFE2l2及其一些已知下游靶點（谷胱甘肽S-轉移酶（GST）和谷胱甘肽還原酶（GSR））的mRNA增加了3倍以上（圖1a）。這種增加是短暫的，并且在運動后2或16小時與休息的肌肉沒有差別（圖1B）。此外，NFE2L2，GST和GSR 的mRNA在運動訓練的小鼠的骨骼肌中升高（圖1C）。盡管測試了幾種市售抗體，但我們無法鑒定出在組織樣品中特異性檢測到NFE2L2的抗體（圖1D）; 然而，我們通過測定骨骼肌、肝臟和心臟中的NFE2L2 mRNA水平，證實NFE2L2 KO小鼠不表達NEF2L2（圖1E）。圖1D中顯示的印跡是使用NFE2L2抗體＃12721（Cell Signaling Technologies）獲得的，但是代表在小鼠肌肉，心臟和肝臟樣本中測試的抗體＃8882（Cell Signaling Technologies）和H300和C20（Santa Cruz Biotechnology）。重要的是要承認，盡管NFE2L2具有65-70kDa的預測分子量，但認為其在95-110kDa處被檢測到（Lau等人，2013）。因此，我們無法確認NFE2L2 mRNA表達導致組織樣品中蛋白質水平增加。然而，由于NFE2L2主要作為轉錄因子，因此其自身和其他靶標（GST和GSR）的mRNA增加證實它受運動調節。
在確定急性運動和運動訓練增加骨骼肌NFE2L2 mRNA后，我們接下來研究了可能在運動過程中誘導NFE2L2表達的刺激因素。使用模擬運動的化合物處理C2C12成肌細胞，包括5 '腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活劑(AICAR)、過氧化氫(H2O2)和NO供體Deta/NO增加NFE2L2蛋白表達(圖1F)。為了確定ROS和NO是否在體內調節運動誘導的NFE2L2 mRNA的增加，在急性運動之前，我們用抗氧化劑NAC或NO合酶抑制劑L-NAME來處理小鼠。NAC將血液還原型谷胱甘肽（GSH）增加至氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比率，表明抗氧化作用和全身氧化應激減少（圖1I）。運動誘導的骨骼肌NFE2L2 mRNA的增加被L-NAME和NAC減弱，NAC也減弱了運動誘導的NFE2L2靶GST和GSR mRNA的增加（圖1G和H）。
圖1. 運動后骨骼肌中NFE2L2的表達
小鼠骨骼肌(腓腸肌)NFE2L2和NFE2L2靶基因(GST和GSR) mRNA在急性(1小時)一輪跑步機運動(A和B)和6周跑步機運動訓練(C)30分鐘后升高。代表性印跡顯示測試的NFE2L2抗體細胞在裂解物中檢測到報道的NFE2L2大?。?5-110kDa）的條帶，而在NFE2L2 shRNA處理的細胞沒有發現；然而，這些抗體無法在組織裂解液中檢測到正確分子量的條帶，而NFE2L2 KO小鼠的裂解液中則沒有這種條帶(D)。NFE2L2 KO小鼠在骨骼肌，肝臟或心臟中不表達NFE2L2 mRNA（E）。用AICAR（1mM）和H2O2（50μM）或Deta / NO（100μM）急性（5小時）處理C2C12成肌細胞增加NFE2L2蛋白表達（F）。用NO合成酶抑制劑（G）或抗氧化劑（NAC）（H）治療小鼠三天減弱了急性（1小時）運動誘導的骨骼?。枘c?。㎞FE2L2、GST和GSR mRNA表達的增加和（I）增加血液GSH：GSSG比率。結果顯示為平均值±SE（細胞培養實驗的每組n = 5-7;小鼠實驗的n分別顯示）。 使用雙尾Student’s t檢驗或具有Fisher最不顯著差異事后歸因分析的單向ANOVA確定顯著性。與休息/對照相比，分別*P<0.05和***P<0.001。與相同條件下未處理組相比，＃P<0.05。 [彩圖在wileyonlinelibrary.com上查看]
3.2 NEF2L2是運動訓練誘導的線粒體生物發生標志物所必需的
ROS和NO參與調控運動誘導的線粒體生物發生(GomezCabrera et al. 2005;Gomez-Cabrera等，2008);而NFE2L2是心肌和肝臟應激刺激線粒體生物發生所必需的(Piantadosi et al. 2008;Piantadosi等人，2011)。因此，我們研究了NFE2L2是否是運動誘導的骨骼肌線粒體生物發生所必需的。運動訓練增加了WT但不是NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌中的mtDNA(線粒體DNA)和檸檬酸合酶活性（線粒體體積標記物）（圖2A和B）。與此相一致，與相同基因型的未訓練小鼠相比，經訓練的WT而不是未訓練的NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌中的線粒體生物發生相關基因mRNA增加（圖2C）。然而，由于個體差異很大，我們無法檢測到PGC1α，mtTFA或細胞色素c氧化酶亞基4（COX4）的骨骼肌蛋白水平在訓練或基因型上有差異（數據未顯示）。
與線粒體生物發生數據一致，運動訓練提高了WT小鼠的有氧和耐力，但沒有提高NFE2L2 KO小鼠的有氧和耐力(圖2D和E)。盡管對WT或NFE2L2 KO小鼠體重沒有訓練效果（圖2F），訓練的WT小鼠的全身能量消耗大于訓練的NFE2L2小鼠的全身能量消耗（圖2G），在未訓練的小鼠中并沒發現這樣的效果并且不是活動水平差異的結果（數據未顯示）（圖2H）。
圖2. NFE2L2是運動訓練誘導的線粒體生物發生所必需的
在跑步機運動訓練（訓練）或正常久坐行為（未經訓練）6周后，在WT和NFE2L2 KO小鼠的骨骼?。枘c?。┲袦y量mtDNA（A），檸檬酸合酶活性（B）和線粒體生物發生相關基因mRNA（C）。經過四周跑步訓練的NRFE2L2 KO小鼠的運動表現(D和E)和能量消耗(G)均低于經過訓練的WT小鼠。WT和NFE2L2 KO小鼠具有相似的體重和活動水平（F和H）。結果顯示為平均值±SE（n分別顯示）。使用具有Fisher最不顯著差異事后歸因分析的單向ANOVA確定顯著性。與相同基因型的未訓練或預訓練小鼠相比，* P <0.05 ** P <0.001。與同條件下的WT相比，＃P <0.05。 EE，能源消耗。 [彩圖可在wileyonlinelibrary.com上查看]
3.3 ROS和NO通過NFE2L2和NRF-1起作用以誘導線粒體生物發生
為了進一步研究NFE2L2在運動誘導的線粒體生物發生中的作用，我們評估了急性運動對WT和NFE2L2 KO小鼠中線粒體生物發生相關基因mRNA的影響（圖3A）。在急性運動后，WT和NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌中PGC1α和COX4 mRNA相似地增加，而NRF-1和mtTFA mRNA僅在WT小鼠的骨骼肌中增加（圖3A）。
然后，我們利用C2C12成肌細胞模型來研究NFE2L2可能通過何種途徑促進骨骼肌線粒體生物發生。用AMPK激活劑(AICAR)對對照組和NFE2L2蛋白(NFE2L2 shRNA)缺乏的細胞進行急性處理(圖1D)。盡管AICAR處理增加了對照和NFE2L2缺陷細胞中PGC1α和mtTFA mRNA水平，但NFE2L2 shRNA阻止了AICAR誘導的NRF-1和COX4 mRNA水平的增加（圖3B）。同樣，NFE2L2 shRNA也減弱了AICAR誘導的mtDNA長時間間歇性增加(圖3C)。為了確定NFE2L2在NO或ROS介導的線粒體生物發生中的作用，對照組和NFE2L2 shRNA細胞分別暴露于NO供體Deta/NO或H2O2的急性處理(圖3D和E)或長時間間歇處理中(圖3F)。在對照組中，急性Deta/NO或H2O2處理增加線粒體生物發生基因mRNA，而NFE2L2 shRNA細胞則沒有。同樣地，使用DeTa/NO或H2O2長時間間歇處理增加了對照組的mtDNA，但沒有增加NFE2L2 shRNA細胞的mtDNA（圖3F）。
因為NRF-1的啟動子區域含有NFE2L2結合位點（Piantadosi＆Suliman，2006），并且NFE2L2缺乏不影響急性運動或AICAR誘導的PGC1α表達（圖3A和B），我們使用siRNA來確定是否NRF-1和PGC1α是NO和ROS介導的下游線粒體生物發生介質mtTFA mRNA的增加所必需的。通過NRF-1的siRNA敲低阻止了Deta / NO和H2O2誘導的mtTFA mRNA增加（圖3G），并且PGC1α siRNA敲低阻止了Deta / NO誘導的但不抑制H2O2誘導的mtTFA增加（圖3H）。
圖3. NFE2L2是急性運動、NO和H2O2誘導線粒體生物合成相關基因mRNA增加所必需的
急性運動后4小時WT和NFE2L2 KO小鼠的骨骼?。枘c?。┲芯€粒體生物發生相關基因mRNA水平（A）。在用AICAR（1mM）（B），Deta / NO（100μM）（D）或H2O2（50μM）（E）處理5小時后，對照shRNA或NFE2L2shRNA C2C12成肌細胞中的線粒體生物發生相關基因mRNA表達。在用AICAR（1mM）（C），Deta / NO（100μM）或H 2 O 2（5μM）（F）處理5天（5小時/天）后，在對照shRNA或NFE2L2 shRNA C2C12成肌細胞中測定mtDNA。在對照組、NRF-1（100nM）（G）或PGC1α（10nM）（H） siRNA轉染后24小時用Deta / NO（100μM）或H2O2（50μM）刺激C2C12成肌細胞持續5小時來評估mtTFA mRNA表達。結果顯示為平均值±SE（對于細胞培養實驗，每組n = 6-8;對于小鼠實驗，n分別顯示）。使用單因素方差分析和Fisher最不顯著差異事后歸因分析確定顯著性。與相同基因型的休息或未處理小鼠或si/shRNA小鼠相比，* P <0.05，** P <0.01 *** P <0.001。與相同條件下的對照組si / shRNA小鼠相比，＃P <0.05。 [彩圖可在wileyonlinelibrary.com上查看]
3.4 ROS，NO和NFE2L2調節運動誘導的抗氧化反應
NO合成抑制劑L-NAME和抗氧化劑NAC阻止急性運動誘導的骨骼肌抗氧化基因超氧化物歧化酶（SOD）1，SOD2，過氧化氫酶，Prx1和Trx1 mRNA的增加（圖4A和B）。雖然SOD1 mRNA水平升高，并且SOD2在未鍛煉的NFE2L2骨骼肌中趨于升高，但急性運動并未進一步增加其水平，也沒有增加過氧化氫酶mRNA（圖4C）。相反，急性運動增加了WT小鼠骨骼肌中SOD1，SOD2和過氧化氫酶的mRNA水平（圖4C）。在運動訓練之后，SOD1，SOD2和過氧化氫酶mRNA在WT的骨骼肌中增加而在NFE2L2KO小鼠中沒有增加（圖4D），而Prx1的mRNA僅通過在NFE2L2KO小鼠的骨骼肌中的訓練而增加。運動訓練增加WT但不是NFE2L2 KO小鼠的骨骼肌SOD活性（圖4E）。盡管具有較低的抗氧化水平，但NFE2L2 KO小鼠骨骼肌中的蛋白氧化(通過氧印跡蛋白羰基化實驗評估)并沒有升高，運動訓練也沒有改變蛋白氧化水平(圖4F)。
圖4. NFE2L2，ROS和NO調節運動誘導的抗氧化反應
采用NO合酶抑制劑(L-NAME) (A)或抗氧化劑(NAC) (B)處理小鼠3天，在急性(1小時)平板運動后30分鐘檢測骨骼肌(腓腸肌)抗氧化劑基因mRNA的表達。急性平板運動(C)或6周平板運動訓練(訓練)或正常久坐行為(未經訓練)后4 h, WT和NFE2L2 KO小鼠骨骼肌(腓腸肌)中抗氧化基因mRNA或SOD活性測定(D和E)。WT和NFE2L2 KO腓腸肌蛋白羰基化水平相似，且不受運動訓練的影響(F)。結果顯示為平均值±SE（n分別顯示）。使用具有Fisher最不顯著差異事后歸因分析的單向ANOVA確定顯著性。與休息或未經訓練的相比，* P <0.05和*** P <0.001。 與未處理的或相同條件下的WT相比，＃P <0.05。CAT，過氧化氫酶; Prx，過氧化物還原酶; Trx，氧碘氧還蛋白。 [彩圖可在wileyonlinelibrary.com上查看]
4. 討論
在本研究中，我們發現NO和ROS在急性運動應激后調節NFE2L2 mRNA水平，NFE2L2表達的中斷損害了急性運動和運動訓練誘導的骨骼肌線粒體生物發生標志物的增加和抗氧化反應。與這些發現一致，缺乏NFE2L2的運動訓練小鼠降低了全身能量消耗和運動表現。本研究首次提供了運動誘導NO和ROS增加可能促進對運動壓力適應機制的因果證據。
人類抗氧化劑補充(Gomez-Cabrera等，2008;Ristow等，2009;Paulsen等(2014a)和嚙齒類動物模型(Gomez-Cabrera等，2005;Strobel等人，2011)已被證明能夠減弱運動誘導的骨骼肌線粒體生物發生標志物的增加。本研究通過提供證據進一步證明，運動期間補充抗氧化劑會減弱NFE2L2的正常激活，并且NFE2L2是線粒體生物反應對運動的氧化還原敏感性的轉錄調節因子。運動激活骨骼肌中的AMPK和p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），這些蛋白激酶被認為通過PGC1α起作用，觸發轉錄因子NRF-1，NRF-2和mtTFA的反應從而誘導線粒體生物合成（Bassel-Duby＆Olson，2006）。盡管抗氧化劑補充劑可以減輕急性運動引起的AMPK和p38 MAPK磷酸化和PGC1α表達的增加（Gomez-Cabrera等人，2005），這并不總是阻止運動訓練導致線粒體生物發生的增加（Wadley等人2013）。此外，缺乏AMPKα2或PGC1α的小鼠對運動表現出正常的線粒體生物生成反應（Jorgensen等人2007年；Leick等人2008）。這表明其他氧化還原敏感途徑可能參與調節響應運動的線粒體生物合成。
我們的研究發現，NFE2L2表達的中斷會損害運動，NO和H2O2誘導的線粒體質量標記物(檸檬酸合酶和mtDNA)的增加得到了先前研究的支持，這些研究表明NFE2L2調節白藜蘆醇、敗血癥和一氧化碳誘導的線粒體生物發生(Piantadosi et al. 2008;Piantadosiet。2011;Kim等，2014)。機制上，NRF-1啟動子區含有NFE2L2結合位點(Piantadosiet al. 2011)，表明NFE2L2激活可誘導NRF-1轉錄，隨后NRF-1可與mtTFA相互作用，驅動線粒體生物發生。急性運動，NO和H2O2誘導的NRF-1和mtTFA的增加依賴于NFE2L2，并且在肌肉細胞中，通過破壞NRF-1來阻止NO和H2O2誘導的mtTFA增加。與我們的肌肉細胞數據一致，嚙齒動物中的NO合酶抑制劑和抗氧化劑補充減少了急性運動后的mtTFA表達（Wadley＆McConell，2007; Wadley等人，2013），并且在大鼠肝細胞瘤中，氧化應激增加了NRF -1與mtTFA的結合（Piantadosi＆Suliman，2006）。這表明ROS和NO可以通過NFE2L2和NRF-1起作用以促進由mtTFA調節的線粒體生物發生。
為了支持這個概念：NFE2L2是線粒體生物發生信號級聯中PGC1α下游途徑的一部分，在缺乏NFE2L2的情況下，AICAR和急性運動均刺激PGC1αmRNA的正常增加。然而，有趣的是，PGC1α的siRNA敲低抑制了了NO但不抑制H2O2介導的mtTFA mRNA的增加?？紤]到AICAR刺激NFE2L2表達和AICAR誘導的線粒體生物發生部分地被NFE2L2 shRNA敲低而抑制，我們推測在涉及PGC1α和NFE2L2促進線粒體生物發生的途徑之間可能存在一定程度的合作。以前的研究表明NO通過涉及cGMP形成和PGC1α誘導的途徑促進線粒體生物發生（Nisoli等，2003; Lira等，2010b）。雖然NO與Keap1半胱氨酸151相互作用以抑制NFE2L2的降解（McMahon等人，2010），從而促進NFE2L2表達，但尚不清楚這是否是運動誘導的NO促進NFE2L2與NRF-1相互作用的機制或是否涉及中間步驟，例如cGMP的形成。無論如何，由于H2O2似乎獨立于PGC1α起作用，PGC1α和NFE2L2可以協同作用和/或是相互獨立的觀點需要進一步關注。
然而，有幾個研究小組報告說，抗氧化劑補充劑不會影響正常的骨骼肌運動反應（Yfanti等人2010; Higashida等人2011; Wadley等人2013）。盡管可變的抗氧化劑補充劑（類型，持續時間和劑量）和運動訓練（模式，持續時間，強度）可能是重要的促成因素（Merry＆Ristow，2015），但這些支持運動線粒體生物發生途徑的發現可能是多余的。實際上，我們表明ROS和NO都有助于急性運動后NFE2L2的激活，這可能表明，盡管清除一個可能有效地減少線粒體對運動信號的生物生成反應，但這種抑制作用已被克服，和/或替代途徑正在上調，伴隨著隨后的發作導致正常的訓練反應。此外，必須承認，在本研究中，我們使用了全身NFE2L2缺陷小鼠，盡管進一步的體內研究應該考慮這些小鼠的鈍性運動反應是肌肉特異性作用的結果還是全身調節的結果。
NFE2L2調控從酵母、秀麗隱球菌到哺乳動物等生物體的基礎抗氧化表達和對應激的抗氧化反應(Kensler et al. 2007;Nguyen等，2009)。最近，已顯示NFE2L2在老年小鼠的骨骼?。∟arasimhan等人，2014）和年輕小鼠的心?。∕uthusamy等人，2012）中進行徹底運動后立即增加抗氧化劑mRNA表達。此外，我們還發現，ROS和NO都參與了NFE2L2在運動過程中的激活，且NFE2L2不僅是急性運動后抗氧化劑表達和抗氧化活性正常增加的原因，而且也是運動訓練的結果。我們還報道SOD1和2的表達在基礎（休息）狀態下上調，并且與WT小鼠不同，在NFE2L2KO小鼠中通過運動訓練增加過氧化物酶1的表達。我們還報道了在基礎(休息)狀態下SOD1和2的表達上調，與WT小鼠不同，在NFE2L2 KO小鼠中，過氧合蛋白1的表達隨著運動訓練的增加而增加。雖然這并沒有轉化為NFE2L2 KO小鼠基礎SOD活性的增加，但這可能是過氧化氫酶和谷胱甘肽代謝相關基因表達減少的代償性反應(數據未顯示;Narasimhan etal . 2014)，表明其他機制也調控骨骼肌抗氧化表達。一個可能的候選者是核因子κ-輕鏈增強子激活的B細胞（NF-κB），已知其參與抗氧化劑表達的轉錄調節，并且維生素C和別嘌呤醇補充抑制運動引起NF-κB表達的增加（Gomez-Cabrera等人2005; Gomez-Cabrera等人2008; Ji，2008）。
在一種被稱為毒物興奮效應(Southam & Ehrlich, 1943)的反應中，ROS和NO應激的急劇增加促進了適應性，保護細胞免受隨后應激的潛在有害影響，并延長了秀麗線蟲和黑腹果蠅的壽命(Ristow & Zarse, 2010)。切除線蟲NFE2L2同源物(skin-1)，消除了干預措施對壽命延長的作用，例如胰島素/胰島素樣生長因子-1信號傳導的損傷（Zarse等人，2012）、葡萄糖胺補充劑（Weimer等人， 2014）和糖酵解抑制（Schulz等人，2007）。重要的是，這些干預措施需要增加ROS來誘導適應性，包括增加線粒體呼吸和抗氧化表達，以延長壽命。因為定期的體育鍛煉也會增加預期壽命（Warburton等人，2006），并且增強的線粒體呼吸和增加的內源性抗氧化劑表達可以預防代謝疾?。↘oves等人，2008; Anderson等人，2009），因此很容易推測 NFE2L2可能參與運動的整個生物體健康促進作用。事實上，NFE2L2激活劑已被證明可以延長秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅的壽命（Suckow＆Suckow，2006; Lee等人，2010），并預防小鼠的代謝疾?。╕u 等，2011; He 等，2012）。然而，令人驚訝的是，NFE2L2的脂肪特異性和全身缺失也減少了遺傳和飲食誘導的肥胖（Chartoumpekis等人2011; Xue等人2013）。這可能表明NFE2L2在調節代謝反應中的組織特異性作用，并表明與慢性缺失與急性激活相關的差異效應。無論如何，這些數據和以前發表的人類研究數據（Gomez-Cabrera等人2008; Ristow等人2009; Paulsen等人2014a; Paulsen等人2014b; Cobley等人2015）表明在正常生理條件下，特別是在運動過程中產生的ROS，是最佳適應和對未來細胞應激源的保護所必需的。這建議不要在人體中不必要地使用抗氧化劑。雖然只是推測，但我們的數據也可能表明，攝入激活NFE2L2的營養素可能對細胞功能有保護作用，類似于運動;然而，這還有待證實。這些結果與興奮理論一致，其中ROS / NO應激的急劇增加啟動細胞和可能的系統范圍的適應性反應，其改善對預期應激的耐受性。
總之，我們的數據表明運動過程中產生的NO和ROS激活骨骼肌NFE2L2。此外，NFE2L2的表達是正常線粒體生物發生和對急性運動&運動訓練的抗氧化轉錄反應所必需的。這些結果與毒物興奮效應相一致，ROS/NO壓力的急劇增加啟動了細胞的適應性反應，可能還啟動了整個系統的適應性反應，從而提高了對預期應激的耐受性。
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