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調控NRF2用于治療疾?。簳r機就是一切
發表于：2020-03-25 作者：admin 來源：本站 點擊量：6517
關鍵詞
癌癥，臨床試驗，疾病，KEAP1，NRF2，治療學
摘要
轉錄因子核因子紅系2（NF-E2）相關因子2（NRF2）是氧化還原、代謝和蛋白質穩態的中樞調節因子，在多種信號級聯放大通路中存在。盡管對NRF2信號復雜性的理解不斷加深，但臨床上只有一種作用于NRF2的治療藥物，富馬酸二甲酯，用于治療多發性硬化癥。關于新療法的發現令人困惑的是，NRF2水平的變化很大程度上取決于生理和病理環境。因此，正確定時和有針對性地操縱NRF2通路對于創建有效的治療方案至關重要。本文總結了NRF2的調節和其下游靶點。此外，我們還討論了NRF2在癌癥、神經退行性病變、糖尿病以及心血管、腎臟和肝臟疾病中的作用，特別強調了基于NFR2的治療方法，包括那些已進入臨床試驗的方法。
引言
轉錄因子核因子紅系2（NF-E2）相關因子2（NRF2）最初被認為是氧化還原穩態的主要調節因子，但它還是多組細胞功能的關鍵中介。通過對新的調節因子、靶基因和疾病背景的持續鑒定，已經表明NRF2不僅在氧化還原穩態中起作用，而且在藥物/異生物質代謝，DNA修復，線粒體功能，鐵、脂類和碳水化合物代謝，蛋白質平衡和增殖中也起作用，所有這些作用都有助于細胞存活（1）。盡管已確定NRF2的益處，但仔細調節NRF2途徑對疾病預防的極端重要性日漸清晰。由于詳細的機理研究揭示了NRF2生理學和病理學之間的復雜相互作用，對依賴上下游調節NRF2信號級聯通路的新化合物的需求不斷增長。
由于新的研究揭示了NRF2信號網絡之前未被重視的復雜性，基于NRF2的療法不斷出現；然而，療法從實驗室到臨床的進展仍然滯后。除此之外，NRF2直接或間接發揮作用的病理環境數量正在迅速增加。本綜述總結了目前已確定的NRF2的調節子和下游靶點，與其他信號通路的相互作用，以及在癌癥和其他疾病中的作用。本綜述還強調了目前已經發展到臨床階段的療法，以及其他可以發展成治療和預防疾病的NRF2藥理學調節劑。
NRF2信號通路綜述
NRF2領域的關鍵發現：歷史視角
對NRF2的研究相對較新，大部分關鍵發現都發生在過去的40年中（圖1）。盡管NRF2于1994年首次被克隆，但抗氧化反應的轉錄控制的最初概念出現在20世紀70年代，當時數項研究表明，酚類抗氧化劑的抗癌作用源于增加II相解毒酶的活化，例如谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）（2, 3）。雖然當時還不清楚GST是否由NRF2調控，但這首先證明解毒活性中間產物的酶的激活可用于預防化學致癌作用，這些酶中許多現已被確定為NRF2轉錄靶點。1989年發現了一種蛋白質NF-E2，其結合的保守序列包含激活蛋白1（AP-1）的核心模體（4）。NF-E2是6種哺乳動物cap’n’collar轉錄因子（堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子）中的第一種被發現與此模體結合的轉錄因子，該模體與其他因子NRF1（5）、NRF2（6）、NRF3（7）、Bach1（8）和Bach2（9）的結合相繼被鑒定。之后在大鼠GST-Ya基因的啟動子中鑒定出該NF-E2/AP-1序列，并響應叔丁基對苯二酚（t-bhq），由此產生了術語抗氧化劑反應元件（ARE）（10）。隨后發現大量的巰基反應性化學物可誘導ARE驅動的基因表達，提示II相解毒酶的轉錄對親電試劑（11）敏感，這是目前許多已鑒定的NRF2活化劑的一個關鍵功能特征。
20世紀90年代中期到后期進行了許多研究，詳細描述了驅動NRF2信號傳導的分子相互作用，并表征了NRF2的結構域（12）。結果表明NRF2與smallMAF（sMAF）蛋白二聚，激活含ARE元件基因的轉錄（13），并確定Kelch樣ECH相關蛋白1（KEAP1）（14）在蛋白質水平上對NRF2進行負向調節。此外，第一只NRF2−/−小鼠誕生且正常發育（15），但在其腸道和肝臟中的GST和NAD（P）H:醌氧化還原酶（NQO1）水平與服用酚類抗氧化劑（13）后的野生型小鼠相比顯著降低。此外，NRF2−/−小鼠在證明NRF2在化學預防中起直接作用至關重要，因為在NRF2−/−小鼠（16）中，奧替普拉（Oltipraz，一種二硫雜環戊硫酮）的化學保護作用丟失。
一旦NRF2的化學保護作用被提出，該領域就轉向了識別激活NRF2通路的方法。由于重要II相解毒酶的許多激動劑都是親電試劑，因此NRF2的氧化還原敏感性被認為是由能夠感知氧化/親電應激的調控子賦予。2002年體外實驗表明，KEAP1通過特定的半胱氨酸殘基感知親電應激，同時將親電誘導劑加和至巰基，破壞了KEAP1-NRF2相互作用（17）。一年后，在細胞中發現不同的KEAP1半胱氨酸對不同的誘導物敏感，這一概念被稱為半胱氨酸代碼（18）。與此同時，研究表明，KEAP1招募了Cullin 3環盒1（CUL3-RBX1）E3泛素連接酶復合物，靶向泛素化NRF2的7個關鍵賴氨酸殘基，降解NRF2（19，20）。不久之后，人們發現糖原合成酶激酶β（GSK3-β）磷酸化NRF2關鍵殘基是一種不依賴KEAP1降解NRF2的途徑，其觸發了S相激酶結合蛋白1-Cullin1-Rbx1/β-轉導素重復序列包含蛋白（SCF/β-TrCP）E3連接酶復合物（21，22）的募集。
2006年發現KEAP1在非小細胞肺癌中發生突變并導致NRF2水平長期升高，首次證明NRF2可能有助于癌癥進展和耐藥性，后來被稱為NRF2的黑暗面（23，24）。這導致了研究高NRF2表達在癌癥中作用的領域發生了轉變，而抑制NRF2可能是治療某些癌癥的前提。另一個與NRF2黑暗面相關的里程碑性發現是自噬功能障礙引起p62依賴性的KEAP1隔離，導致NRF2以一種非正常、不依賴半胱氨酸的方式長時間激活（25，26）。隨著NRF2研究領域的不斷擴大，我們對這條通路復雜性的理解也在不斷推進。
圖1 在過去40年中，在NRF2研究領域的關鍵發現?？s寫：ARE，抗氧化反應元件；ER，內質網。
負調節子和激活NRF2的模式
NRF2的調節主要通過控制維持NRF2蛋白水平來實現。三種E3泛素連接酶復合物負責NRF2、CUL3-RBX1-KEAP1復合物、SCF/β-TrCP復合物和HRD1復合物的泛素化和降解。每一種E3泛素連接酶復合物都能在特定亞細胞間室內的不同刺激下調控NRF2的降解。細胞質基質中的CUL3-RBX1-KEAP1復合物響應親電/氧化應激。細胞核或細胞質基質中的SCF/β-TrCP復合物對代謝變化更敏感，由GSK3-β調節。HRD1定位于內質網（ER），并且被證實僅在ER應激期間泛素化NRF2（27）。值得注意的是，其他信號通路、表觀遺傳因子和翻譯后修飾（PTMs）也同樣調節NRF2。此外，通過靶向NRF2的負調控可以實現NRF2通路的激活或抑制（圖2）。
圖2 NRF2的調節和可能激活模式的示意圖。NRF2在轉錄后和翻譯后水平以及通過表觀遺傳因子和與其他信號通路的相互作用進行調節。NRF2蛋白水平的調節可以通過激活或抑制CUL3-RBX1-KEAP1復合物、SCF/β-TrCP復合物或HRD1來實現。關鍵半胱氨酸的親電/氧化修飾、含ETGE的蛋白質的競爭性結合、蛋白質-蛋白質相互作用抑制劑、p62/SQSTM1、mTOR抑制劑和CUL環E3連接酶抑制劑（例如MLN4924）的水平升高都可能破壞KEAP1-NRF2相互作用。KEAP1啟動子的高甲基化也可以增加NRF2的表達。SCF/β-TrCP-NRF2相互作用可通過胰島素/生長因子或GSK3-β、CUL環E3連接酶、PI3K-AKT-PKC、mTOR、ERK/p38 MAPK和WNT抑制劑進行調節。HRD1抑制劑（例如LS-102）可用于防止NRF2內質網應激相關降解?？s寫：ER，內質網；ROS，活性氧。
NRF2靶基因
目前已經鑒定出超過250個NRF2靶基因，其參與了多種細胞過程，包括氧化還原調節、I-III相藥物/異生物質代謝、蛋白質穩態、DNA修復、碳水化合物和脂質代謝、鐵穩態、轉錄調節和線粒體功能（圖3）。
圖3 由Nrf2靶基因驅動的細胞通路。NRF2與sMAF蛋白異二聚體化，啟動含抗氧化反應元件靶基因的轉錄。已證實的NRF2靶基因參與了蛋白酶體組裝、自噬、防止細胞凋亡、維持氧化還原平衡、脂質和碳水化合物代謝、血紅素代謝、鐵穩態、藥物/異生物質代謝的所有三相、其他轉錄因子的轉錄調節和DNA修復。代表性靶基因包含在每個轉錄應答下面的括號中?？s寫：GSH，谷胱甘肽。
氧化還原調控。也許最著名的功能是維持氧化還原平衡，主要是通過谷胱甘肽和基于巰基抗氧化酶的合成和氧化還原循環。例如，負責谷胱甘肽（GSH）從頭合成的谷氨酸-半胱氨酸連接酶（GCL）的催化和調節亞單位（GCLC和GCLM）是NRF2靶基因。此外，利用谷胱甘肽減少過氧化物的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX2和GPX4）、減少氧化態谷胱甘肽的谷胱甘還原酶（GSR）和直接減少過氧化物的過氧氧化還原蛋白（PRDX1和PRDX6）均是NRF2靶基因（28）。通過硫氧還蛋白1和硫氧還蛋白還原酶1（TXN1和TXNRD1）的協同作用減少氧化的蛋白巰基，與通過xCT轉運體（SLC7A11）導入對谷胱甘肽產生至關重要的半胱氨酸，也都由NRF2轉錄調節（28）。
藥物/異生物質代謝。NRF2調節藥物/異生物質代謝的所有三相。參與I相代謝的NRF2靶點的例子是醛酮還原酶家族成員（例如AKR1C1、AKR1B1和ARK1B10）（29）、醛脫氫酶家族成員（例如ALDH1A1、ALDH3A1和ALDH7A1）（30）和NQO1（13），這些酶都參與將毒物/藥物還原為活性代謝物。這使得包括GSTs（例如GSTA1-4和GSTM1-4）（31）和UDP葡萄糖醛酸轉移酶（例如UGT1A1和UGT2B7）（32，33）在內的II相NRF2轉錄靶點分別與GSH或葡萄糖醛酸結合。最后，NRF2還調節III相膜轉運蛋白（ATP結合盒家族成員/多藥耐藥蛋白，例如ABCC1–5和ABCG2）（34，35）的轉錄，而這些轉運蛋白將異生物質/藥物從細胞中排出。
蛋白質穩態。NRF2下游基因通過自噬和泛素-蛋白酶體系統參與維持蛋白穩態。最近發現一些自噬起始蛋白，包括自噬相關（ATG）5和7，以及unc-51樣自噬激活激酶（ULK）1和2，被認定含有AREs（36）。NRF2可直接調節蛋白質翻譯和自噬的主調節子mTOR（37）。此外，p62/SQSTM1作為一種以泛素化蛋白質為靶點進行自噬降解的蛋白質，也是NRF2靶點。NRF2還控制蛋白酶體亞單位[例如蛋白酶體亞單位α1（PSMA1）和蛋白酶體亞單位β5（PSMB5）]（38）以及蛋白酶體成熟蛋白（POMP）（39）的表達，其對蛋白酶體組裝至關重要。
脂質、碳水化合物和鐵代謝。NRF2調節多種葡萄糖和脂肪酸合成代謝所必需的代謝酶。戊糖磷酸途徑酶，包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（PGD）和轉醛酶（TALDO1），在NADPH再生過程中起著關鍵作用，且均為NRF2靶基因（40）。NRF2還調節蘋果酸酶（ME1）和異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）這兩種關鍵三羧酸循環酶的表達（40，41）。脂類分解代謝受NRF2調控，脂肪酶H（LIPH）、磷脂酶A2（PLA2G7）和乙酰輔酶A氧化酶2（ACOX2）（42）均是NRF2的靶點。最后，NRF2通過轉錄血紅素加氧酶1（HMOX1）、膽綠素A和B（BLVRA/B）以及鐵蛋白輕鏈和重鏈（FTH1/FLH1）（43）調節血紅素代謝和鐵穩態。
轉錄調控、DNA修復和阻止凋亡。數種轉錄因子的啟動子內已經鑒定出ARE功能區，包括芳基烴受體（AhR）、神經源性位點Notch同系物蛋白1（Notch1）和視網膜受體α（RXRA），這表明NRF2可以間接控制許多不含ARE的基因的轉錄，以下詳述。NRF2也在DNA損傷修復和阻止凋亡中發揮作用，因為p53結合蛋白1（53BP1）、DNA修復蛋白Rad51同系物1（RAD51）（44）、抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤2（BCL2）和B細胞淋巴瘤特大（BCLXL）（45，46）由NRF2轉錄調節。NRF2靶點的多樣性表明了NRF2在調節細胞功能中的中心作用。
與其他信號通路的串擾
盡管NRF2通過其轉錄靶點直接調節許多細胞反應，但其也可通過與其他主要信號級聯通路的串擾來調節細胞功能。這些通路對應激反應至關重要，包括Notch1、AhR、核因子-κB（NF-κB）、細胞腫瘤抗原p53（p53）、AMP活化蛋白激酶（AMPK）、PI3K-AKT和mTOR，突顯了NRF2在維持細胞存活中的關鍵作用。
Notch信號通路介導胚胎發育過程中的細胞周期和凋亡以及決定細胞命運。NOTCH1基因在其啟動子的近端區域具有ARE功能區，并且Notch信號在NRF2−/−小鼠胚胎成纖維細胞中減弱（47）。NRF2-NOTCH信號軸在肝臟再生過程中至關重要，因為部分肝切除后的NRF2−/−小鼠與野生型小鼠相比肝再生延遲；然而，將這些小鼠與過度表達NOTCH胞內結構域（NICD）的小鼠雜交，完全挽救了NRF2無表型小鼠（47）。相反，NRF2可以通過NOTCH調節，因為在動物的NRF2啟動子區域中，典型NOTCH轉錄所需的RBPjκ序列高度保守。此外，NICD過表達小鼠的NRF2過度活化，表現出與肝特異性KEAP1−/−小鼠非常相似的表型（48）。因此，NRF2和NOTCH之間的相互作用似乎在介導細胞保護，特別是在肝再生的方面起不可或缺的作用。
NRF2信號也與對外源性應激反應的通路重疊。例如，與芳基烴受體核轉運體形成復合物的AhR，可以被多環芳烴（例如二惡英）結合，并從胞質溶膠轉移到細胞核，以調節含異生物質反應元件（XRE）基因的轉錄（49）。NRF2及其一些靶基因，如 GST （50）和NQO1（51），也含有XRE。此外，研究還表明，NRF2可以通過ARE（52）直接調控AhR轉錄，也可以通過巴多酮-咪唑內酯（CDDO-Im；合成，三萜類）的誘導調控AhR靶基因轉錄（53）。
另一個與NRF2雙向相關的主要通路是NF-κB途徑?，F已證明，NF-κB抑制了含有AREs基因的轉錄，因為NRF2和p65/RelA（一種NF-κB轉錄復合物的組成部分）都需要CREB結合蛋白（CBP）來轉錄各自的靶基因（54）。因此，如果p65與CBP結合，會阻止由NRF2驅動的ARE轉錄。有趣的是，幾種NRF2活化劑，包括蘿卜硫素（SF）（55）、甲基巴多酮（CDDO-Me）（56）和姜黃素（57），已被證明能夠抑制NF-κB信號傳導。相反，與野生型小鼠相比，NRF2−/−小鼠在促炎刺激后表現出更多的NF-κB活化跡象（58）。NF-κB激酶β亞單位（IKKβ）的抑制劑作為一種公認的NF-κB負調節因子，已證明被CUL3-RBX1-KEAP1復合物（59）泛素化和降解。最后，幾個NRF2靶基因，如NQO1、TRX1和HMOX1，已經被證明可調控NF-κB驅動的轉錄，這表明這些通路在上下游水平（60）發生交叉。
NRF2直接與p53/p21級聯相互作用，而p53/p21級聯是抗癌治療的重要靶點，其調節細胞凋亡。具體來說，NRF2和p53的共表達導致多種細胞系（61）中SLC7A11、NQO1和GST的抑制。研究表明，NRF2可以調控p53的負調節因子E3泛素蛋白連接酶MDM2的表達，表明NRF2可以直接調控p53的活性（62）。此外，p21（CDKN1A），一種參與細胞周期、凋亡和分化調節的p53靶基因，直接與NRF2的DLG和ETGE模體結合，從而穩定和轉錄含ARE的基因（63）。NRF2和p53之間的相互作用被以下事實進一步證明，即NRF2−/−；p53+/−小鼠比其NRF2−/−或p53+/−小鼠（64）更容易受到亞硝胺誘導的致癌作用，其表明NRF2和p53在介導應激期細胞生存方面至關重要。
NRF2也與對新陳代謝變化作出反應的關鍵通路相互作用。例如，AMPK，一種通過AMP:ATP比率來檢測細胞整體能量狀態的傳感器，磷酸化NRF2的S550處，增強其核易位（65）。同樣地，β-TRCP降解NRF2所必需的GSK3-β可被PI3K-AKT信號軸（66）或mTOR（67）磷酸化，這表明NRF2的穩定性可以由這兩個通路決定。也有研究表明，mTOR磷酸化p62/SQSTM1，增強其與KEAP1的相互作用，導致p62-KEAP1復合物的自噬降解和NRF2的上調（68）?？偟膩碚f，NRF2與數個決定了細胞生長和存活的關鍵信號級聯相互作用。
NRF2調節的其他模式
NRF2信號通路的表觀遺傳控制，以及影響NRF2表達的KEAP1和NRF2/NFE2l2中幾個單核苷酸多態性，已在癌癥背景下被廣泛研究。啟動子甲基化調節NRF2和KEAP1，以及幾個NRF2靶基因的表達，包括GST、NQO1、GPX和UGT1A1（69）?；熆梢越档蚇RF2啟動子的甲基化，例如在耐藥結腸癌中5-氟尿嘧啶（5-FU）可誘導活性氧物種（ROS）生成，導致NRF2啟動子的低甲基化，升高NRF2水平（70）。NRF2活性可受KEAP1啟動子的高甲基化影響，導致NRF2的表達增加。并不是所有的表觀遺傳修飾都能增強NRF2的活性，例如晚期前列腺癌中NRF2啟動子的高甲基化抑制NRF2（71）。組蛋白的乙?；?去乙?；图谆?去甲基化，以及microRNAs，也被證明影響NRF2的激活（69）。需要更多的研究來確定潛在表觀遺傳靶點來調節疾病中的NRF2通路。
除了泛素化和磷酸化NRF2的Neh2和Neh6結構域中關鍵殘基調控其穩定性外，NRF2還可以通過其他幾種PTMs（post-translational modifications，翻譯后修飾）進行修飾，包括甲基化、乙?；皖惙核鼗揎?。通過p300/CBP乙?；疦eh1結構域的關鍵賴氨酸殘基增強其DNA結合能力，可提高NRF2的活性，且去乙?；?2）能逆轉。NRF2在R437位點上的甲基化也影響其轉錄活性（73）。如前所述，NRF2的磷酸化導致其降解；然而，其他絲氨酸殘基（s40、s215、s408、s550和s577）也可被數種上游激酶磷酸化（65、74、75）。盡管NRF2轉錄活性的影響可能取決于激酶/絲氨酸組合，但這些絲氨酸殘基的磷酸化被認為增加了NRF2向細胞核的易位。另一種確認的NRF2的PTMs是類泛素化修飾，它增強了HepG2細胞（76）中NRF2的泛素化和降解，而在胰腺β-胰島細胞中，它增強了NRF2活性并促進了細胞存活（77），表明了NRF2的PTMs的細胞類型-特異性相關性。
靶向NRF2用于疾病
調控NRF2預防和治療癌癥和其他慢性疾病
在NRF2研究領域有一個正在發展的主題，即疾病條件下依賴于環境和時間的靶向NRF2。利用藥物活化NRF2的有益作用仍然是基于NRF2化學預防和干預其他慢性疾病的一個重要方面，如神經退行性病變、糖尿病、心血管疾病以及慢性腎臟和肝臟疾病。然而，越來越多的研究表明，在某些癌癥和疾病階段，NRF2水平已經很高，這表明也應考慮設計減輕與延長NRF2活化相關的潛在有害或轉化效應的藥物。圖4總結了當前NRF2活化劑和抑制劑以及疾病中NRF2表達水平的示例。
圖4 NRF2活化劑/抑制劑以及基于癌癥和其他慢性疾病中NRF2水平的當前治療方案。在疾病中靶向NRF2依賴于時間和表達水平。幾種NRF2活化劑和抑制劑已被鑒定可用于轉化治療。成為臨床試驗的療法被突出顯示（星號）。DMF（Tecfidera；bold）是該組中唯一一種FDA批準的藥物。NRF2水平和治療可能性隨疾病時間和階段而異。在癌癥啟動期或神經退行性或慢性炎癥疾病發作之前，NRF2激動劑被認為提供了最大的治療益處。一些疾病，如糖尿病、心血管疾病、前列腺癌、炎癥性疾病和啟動后階段/早期癌癥，根據具體情況，已報告具有低或高水平的NRF2。發病后的治療選項以NRF2為靶點，以干預和預防或延緩病情發展。許多癌癥類型表現出高水平的組成性NRF2。對于高水平的NRF2具有有害作用的疾病，NRF2抑制劑或輔助方法將是最有效的。癌癥和晚期高水平NRF2的疾病通常與預后不良有關，在這一階段的治療旨在減輕癥狀和提高其他療法的療效?？s寫：ATRA，全反式維甲酸；D3T，3H-1,2-二硫雜茂-3-硫酮；DMF，富馬酸二甲酯；FDA，美國食品藥品監督管理局；t-BHQ，叔丁基對苯二酚。
NRF2用于化學預防。迄今為止，已有數百項研究評估了激活NRF2的化合物（78，79）的體外和體內化學預防性能。重要的是，大多數化學預防化合物（或其生物活性代謝物）是親電試劑，并通過對半胱氨酸的修飾激活NRF2，盡管結合KEAP1的Kelch結構域的肽和小分子也已被開發（80）。迄今為止，蘿卜硫素（天然，異硫氰酸酯）、CDDO-Me（合成，三萜類）、RTA 408（合成，三萜類，奧馬維洛酮）和富馬酸二甲酯（DMF；合成，Tecfidera）是僅有的進入美國臨床試驗的NRF2活化劑，只有Tecfidera被批準用于治療多發性硬化癥（MS）。顯然，基于NRF2的安全、有效和特定療法的發展仍然是癌癥預防的一個探索領域。然而，關于使用NRF2活化劑可能促進NRF2黑暗面并支持先前存在腫瘤的進展，這一點仍存在爭議。因此，根據NRF2水平和癌癥分期，目標人群和給藥方案應非常仔細地定時和規劃。
組成性NRF2在癌癥中的激活。考慮到NRF2的生存優勢，癌細胞劫持NRF2通路并不奇怪。Kelch或KEAP1介導區域的突變降低了其與NRF2的相互作用，導致肺癌細胞系和組織的組成性活化（81）。此外，KEAP1中的一些體細胞突變以及野生型等位基因雜合子的丟失，提高了NRF2水平并產生了耐藥性（23）。重要的是，研究證實，在肺腺癌中，KEAP1的突變頻率與TP53相同，而在肺鱗癌中，KEAP1和NRF2是突變頻率最高的基因（82，83）。據癌癥基因組圖譜項目報告，超過30 %的鱗狀細胞癌病例（84例）中KEAP1與NRF2發生突變和拷貝數改變，以及CUL3的缺失或突變。研究還發現，由于CUL3缺失或啟動子甲基化，RBX1的表達降低（85，86）。表1總結了導致NRF2組成性激活的機制以及觀察到的癌癥類型。
表1 NRF2通路基因的遺傳改變導致NRF2高表達和其所對應的腫瘤類型。
縮寫：CNV，拷貝數變異；LOH，雜合子丟失
NRF2抑制劑在克服癌癥抵抗中的作用。從天然產物提取物的篩選結果中發現了第一種NRF2抑制劑，Brusatol（天然，類西林類）（105）。Brusatol通過降低NRF2及其靶基因的蛋白質水平，使一些癌細胞系對化療藥物敏感（105）。在異種瘤移植模型中，Brusatol與順鉑聯合使用可提高肺癌細胞的化療敏感性，在小鼠肺癌模型（LSL-KrasG12D/+）（105）中提高了腫瘤總負荷。盡管最近的兩份出版物已經確定了Brusatol是一種全局翻譯抑制劑（106，107），但它仍是研究NRF2在癌癥化學增敏中的抑制作用的有用工具，因為諸如NRF2等短壽命蛋白最容易受到蛋白質翻譯抑制。氟哌酮（人工合成，生物堿）也已被證明通過抑制全局蛋白質翻譯使依賴于氟哌酮的癌細胞對抗癌藥物敏感（108）。
其他的NRF2抑制劑包括：ARE表達調節劑1（AEM1），一種具有未知作用機制的小分子抑制劑（109），和ML385，一種結合到NRF2的Neh1結構域的分子，阻止NRF2同MAFG二聚與結合ARE的過程（110）。ML385是目前最有趣的抑制劑，但它有一個意料之外的作用，即導致NRF2的mRNA和蛋白質水平呈劑量和時間依賴性的顯著下降。這種下降不太可能是直接抑制與ARE的結合，因此需要進一步調查。沒有精確定義作用模式的負向調節NRF2活性的其他天然產物包括：甘露酮（111）、馬拉巴尼酮A（112）、赭曲霉素A（113）和沃戈寧（114）。此外，由于核受體可直接結合NRF2并抑制其激活活性，一些研究提出地塞米松/布地奈德（糖皮質激素受體激動劑）和全反式維甲酸（ATRA；維甲酸受體激動劑）作為NRF2抑制劑（115）。然而，這些化合物的主要靶點是核受體而不是特定的NRF2，因此這些靶點不太可能作為NRF2靶點療法開發。
神經退行性病變中的NRF2。與癌癥相似，NRF2在神經退行性疾病中的作用是復雜的。有趣的是，NRF2的表達減少與神經干細胞功能（116）隨年齡相關下降有關，并且NRF2對氧化應激的反應也隨著年齡增長而降低（117）。在神經退行性病變過程中，NRF2可以被激活或抑制，這取決于受影響的細胞類型和疾病的階段。例如，一些研究表明，在阿爾茨海默?。ˋD）患者的大腦中，NQO1和HMOX1減少，而另一些研究表明，NRF2仍然局限于細胞質基質，導致靶基因表達降低（118）。在活動的巨噬細胞和星形膠質細胞中，NRF2和NQO1表達升高，但在非活動的巨噬細胞和星形膠質細胞以及MS病變中，NQO1、HMOX1和PRDX水平持續升高，并且在帕金森?。≒D）患者的黑質中觀察到NRF2的核定位（118）。相反，肌萎縮側索硬化患者的初級運動皮層和脊髓中的NRF2蛋白水平降低（119）。這些差異可能是特定于細胞類型和大腦區域的，但也可能是由于所調查疾病階段的結果。由于NRF2通路的反應性隨著年齡增長而降低，NRF2可能在疾病早期激活，在疾病后期下降。
一些NRF2的藥理活性劑改善神經退行性表型。巴多酮甲酰胺（合成，三萜類，CDDO-MA）已被證明能改善轉基因AD小鼠的記憶，減少淀粉樣β斑塊的形成（120）。同樣，葛根素（天然，植物雌激素）、蘿卜硫素、葒草苷（天然，黃酮）和黃芩苷（天然，黃酮）改善了AD表型（121-124）。3H-1,2-二硫醇-3-硫酮（天然，二硫雜茂硫酮，D3T）和巴多酮乙酰胺/三氟乙酰胺（合成，三萜類，CDDO-EA/TFEA）可保護野生型小鼠，但不保護NRF2−/−小鼠和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的PD小鼠（125，126）。DMF是目前唯一通過三期臨床試驗治療多發性硬化癥的NRF2激動劑；然而，最近使用蘿卜硫素、CDDO-TFEA和苦參堿（天然生物堿）的研究顯示，它們惡化小鼠表型（127-129）。令人好奇的是，DMF是該組中唯一一種獲得美國食品藥品監督管理局批準的藥物，盡管它不是最有效的NRF2激動劑，這可能是由于NRF2不依賴于免疫調節（130）、與其他途徑的協同作用，或者NRF2激活的程度取決于疾病背景。
NRF2在糖尿病中的雙重作用。在I型和II型糖尿病中也證實了NRF2的失調。氧化應激增加是糖尿病的一個普遍特征，它導致許多組織的細胞功能障礙和代謝變化。然而，與癌癥和神經退行性病變中的NRF2相似，NRF2在糖尿病中作用復雜，其取決于組織和細胞類型。在鏈脲佐菌素誘導的I型糖尿?。?31）小鼠模型中，SF和肉桂醛（CA，天然，黃酮）均能抑制氧化損傷并恢復正常腎功能?？诜﨏DDO-Im可增強db/db小鼠的NRF2活性，降低糖尿病表型（132）。CDDO-Im、CDDO-Me、奧替普拉和姜黃素改善了遺傳性與高脂肪飲食誘導的糖尿病2種模型（133-136）中的胰島素敏感性和葡萄糖耐受性。
有趣的是，具有較高NRF2組成水平的KEAP1flox/−小鼠與db/db小鼠（132）雜交時，也表現出延遲糖尿病發作；然而，其他研究表明，KEAP1基因敲除增強了Lepob/ob小鼠和高脂肪飲食（137，138）小鼠的糖尿病表型，這表明飲食和遺傳因素導致了糖尿病的發生?？刂芅RF2可能對糖尿病的發病和進展有不同的影響。CDDo-Me被證明能增強糖尿病腎病患者的腎功能并減輕其體重（139）；然而，由于心血管事件的風險增加，該研究被終止。重要的是，改進特異性和適當的臨床環境仍然可以為這類和其他基于NRF2藥物（140）產生積極的結果。
NRF2在心血管、腎臟和肝臟疾病中的作用。心血管疾病包括從高血壓到冠狀動脈疾病的各種疾病。與其他慢性疾病一樣，許多心血管疾病的進展可能需要幾十年。心血管疾病的一個常見特征是增加對內皮細胞和心肌細胞的氧化損傷，其可引起心臟功能失常，心臟和血管系統的慢性損傷，導致心力衰竭。蘿卜硫素、t-BHQ、MG132、白藜蘆醇和α-脂肪酸對NRF2的藥理學激活，被證明可以挽救心力衰竭的大鼠（141）。相反，αB晶體蛋白突變的心肌肥大小鼠模型中NRF2慢性激活導致還原性應激（142），這表明NRF2的受控激活可以預防心臟功能障礙，而延長激活可能會導致有害影響。
慢性氧化應激和炎癥也是慢性腎?。–KD）和慢性肝病的常見特征。至少對于沒有心臟危險因素的患者，CDDO-Me仍然是最有希望的治療方法，已達到臨床試驗階段（143），并且CDDO-Im已證明可預防藥物誘導的肝損傷，并減少非酒精性脂肪性肝病模型（144）中的肝臟脂肪積累。這些研究表明，在與慢性炎癥和ROS產生相關的疾病中，NRF2的激活可保護機體免受氧化應激；然而，延長NRF2通路的激活可導致代謝變化，引起還原應激促進疾病進展。
靶向NRF2的臨床試驗和基于NRF2療法的藥物重新定位
如上所述，幾種NRF2活化劑已開始臨床試驗，以治療多種病理；然而，只有DMF已被批準用于治療復發性MS。目前最流行的一種方案是膳食補充蘿卜硫素，測試對慢性阻塞性肺?。–linicalTrials.gov Identifier NCT01335971）（145）、暴露于臭氧和其他空氣污染物（NCT01625130, NCT01437501）（146，147）、囊性纖維化（NCT01315665）、哮喘（NCT01845493）、鐮狀細胞?。∟CT01715480）（148）的治療，頭頸癌（NCT03182959，NCT03268993和NCT03402230）療效有限或尚未報告。最近的幾項臨床試驗還測試了蘿卜硫素對自閉癥譜系障礙（NCT0256148）和精神分裂癥（NCT01716858）（149）相關癥狀的治療，以及在II型糖尿病患者中正進行一項研究（NCT0281448）。有趣的是，局部蘿卜硫素在保護皮膚免受紫外線相關損傷方面進行了測試（NCT03126539）。其他的NRF2活化劑也在研究中，如姜黃素治療晚期糖尿病腎?。∟CT03262363），以及最近完成的白藜蘆醇治療慢性腎?。∟CT02433925）的試驗。RTA 408對線粒體肌病患者（NCT0225422）和弗里德賴希共濟失調患者（NCT02255435）的試驗正在進行。
藥物重新定位的想法也越來越受歡迎。最近的兩個例子是DMF治療PD（150）和Bardoxolone治療鐮狀細胞?。?51）和肺動脈高壓（NCT02036970）。利用藥物化學方法衍生已有的治療方法來提高其特異性和療效是另一種有趣的可能性。此外，最近研究趨勢向非親電小分子NRF2-KEAP1相互作用的調節劑轉變，以減少脫靶效應（80）。研究目的應該是發現新的療法和優化目前的方法。
總結要點
1、NRF2與病理狀態之間關系復雜，開發有效治療方法之前需要仔細評估。
2、通過靶向NRF2的負調節子，可以激活NRF2途徑。
3、抑制NRF2途徑已被證明是一種挑戰，最有希望的策略是干擾NRF2-sMAF-ARE結合。
4、NRF2通過AREs直接或間接調控其他轉錄因子控制多個轉錄靶點，表明其在細胞存活中的核心作用。
5、激活NRF2在實驗性疾病模型中顯示出巨大的成功；然而，許多癌癥/代謝性疾病的NRF2水平長期升高，表明在某些情況下需要靶向NRF2抑制劑。
6、盡管有幾種NRF2活化劑已用于臨床試驗，但只有DMF被FDA批準用于治療MS。
7、通過現有藥物的用途改變或衍生化，重新定位NRF2療法可能會增加基于NRF2療法的數量。
未來問題
1、我們如何縮小從實驗室到臨床治療間的距離？盡管過去20年的研究已經清楚地表明了NRF2在疾病中的雙重作用，但臨床批準的治療方法的數量僅限于DMF。
2、在疾病中靶向NRF2的正確時機是什么？NRF2的有益或有害激活與時間和疾病背景有關，這對發展基于NRF2的治療方案提出了重大挑戰。
3、為什么激動劑間存在差異？已報道了多種NRF2激動劑，但它們顯示了ARE調控基因的差異激活和疾病相關效應，可能是由于與其他調節模式的協同效應。
4、能開發出特定的NRF2抑制劑嗎？需要NRF2的靶向抑制劑，因為目前的選擇已顯示出脫靶效應。
癌癥，臨床試驗，疾病，KEAP1，NRF2，治療學
摘要
轉錄因子核因子紅系2（NF-E2）相關因子2（NRF2）是氧化還原、代謝和蛋白質穩態的中樞調節因子，在多種信號級聯放大通路中存在。盡管對NRF2信號復雜性的理解不斷加深，但臨床上只有一種作用于NRF2的治療藥物，富馬酸二甲酯，用于治療多發性硬化癥。關于新療法的發現令人困惑的是，NRF2水平的變化很大程度上取決于生理和病理環境。因此，正確定時和有針對性地操縱NRF2通路對于創建有效的治療方案至關重要。本文總結了NRF2的調節和其下游靶點。此外，我們還討論了NRF2在癌癥、神經退行性病變、糖尿病以及心血管、腎臟和肝臟疾病中的作用，特別強調了基于NFR2的治療方法，包括那些已進入臨床試驗的方法。
引言
轉錄因子核因子紅系2（NF-E2）相關因子2（NRF2）最初被認為是氧化還原穩態的主要調節因子，但它還是多組細胞功能的關鍵中介。通過對新的調節因子、靶基因和疾病背景的持續鑒定，已經表明NRF2不僅在氧化還原穩態中起作用，而且在藥物/異生物質代謝，DNA修復，線粒體功能，鐵、脂類和碳水化合物代謝，蛋白質平衡和增殖中也起作用，所有這些作用都有助于細胞存活（1）。盡管已確定NRF2的益處，但仔細調節NRF2途徑對疾病預防的極端重要性日漸清晰。由于詳細的機理研究揭示了NRF2生理學和病理學之間的復雜相互作用，對依賴上下游調節NRF2信號級聯通路的新化合物的需求不斷增長。
由于新的研究揭示了NRF2信號網絡之前未被重視的復雜性，基于NRF2的療法不斷出現；然而，療法從實驗室到臨床的進展仍然滯后。除此之外，NRF2直接或間接發揮作用的病理環境數量正在迅速增加。本綜述總結了目前已確定的NRF2的調節子和下游靶點，與其他信號通路的相互作用，以及在癌癥和其他疾病中的作用。本綜述還強調了目前已經發展到臨床階段的療法，以及其他可以發展成治療和預防疾病的NRF2藥理學調節劑。
NRF2信號通路綜述
NRF2領域的關鍵發現：歷史視角
對NRF2的研究相對較新，大部分關鍵發現都發生在過去的40年中（圖1）。盡管NRF2于1994年首次被克隆，但抗氧化反應的轉錄控制的最初概念出現在20世紀70年代，當時數項研究表明，酚類抗氧化劑的抗癌作用源于增加II相解毒酶的活化，例如谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）（2, 3）。雖然當時還不清楚GST是否由NRF2調控，但這首先證明解毒活性中間產物的酶的激活可用于預防化學致癌作用，這些酶中許多現已被確定為NRF2轉錄靶點。1989年發現了一種蛋白質NF-E2，其結合的保守序列包含激活蛋白1（AP-1）的核心模體（4）。NF-E2是6種哺乳動物cap’n’collar轉錄因子（堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子）中的第一種被發現與此模體結合的轉錄因子，該模體與其他因子NRF1（5）、NRF2（6）、NRF3（7）、Bach1（8）和Bach2（9）的結合相繼被鑒定。之后在大鼠GST-Ya基因的啟動子中鑒定出該NF-E2/AP-1序列，并響應叔丁基對苯二酚（t-bhq），由此產生了術語抗氧化劑反應元件（ARE）（10）。隨后發現大量的巰基反應性化學物可誘導ARE驅動的基因表達，提示II相解毒酶的轉錄對親電試劑（11）敏感，這是目前許多已鑒定的NRF2活化劑的一個關鍵功能特征。
20世紀90年代中期到后期進行了許多研究，詳細描述了驅動NRF2信號傳導的分子相互作用，并表征了NRF2的結構域（12）。結果表明NRF2與smallMAF（sMAF）蛋白二聚，激活含ARE元件基因的轉錄（13），并確定Kelch樣ECH相關蛋白1（KEAP1）（14）在蛋白質水平上對NRF2進行負向調節。此外，第一只NRF2−/−小鼠誕生且正常發育（15），但在其腸道和肝臟中的GST和NAD（P）H:醌氧化還原酶（NQO1）水平與服用酚類抗氧化劑（13）后的野生型小鼠相比顯著降低。此外，NRF2−/−小鼠在證明NRF2在化學預防中起直接作用至關重要，因為在NRF2−/−小鼠（16）中，奧替普拉（Oltipraz，一種二硫雜環戊硫酮）的化學保護作用丟失。
一旦NRF2的化學保護作用被提出，該領域就轉向了識別激活NRF2通路的方法。由于重要II相解毒酶的許多激動劑都是親電試劑，因此NRF2的氧化還原敏感性被認為是由能夠感知氧化/親電應激的調控子賦予。2002年體外實驗表明，KEAP1通過特定的半胱氨酸殘基感知親電應激，同時將親電誘導劑加和至巰基，破壞了KEAP1-NRF2相互作用（17）。一年后，在細胞中發現不同的KEAP1半胱氨酸對不同的誘導物敏感，這一概念被稱為半胱氨酸代碼（18）。與此同時，研究表明，KEAP1招募了Cullin 3環盒1（CUL3-RBX1）E3泛素連接酶復合物，靶向泛素化NRF2的7個關鍵賴氨酸殘基，降解NRF2（19，20）。不久之后，人們發現糖原合成酶激酶β（GSK3-β）磷酸化NRF2關鍵殘基是一種不依賴KEAP1降解NRF2的途徑，其觸發了S相激酶結合蛋白1-Cullin1-Rbx1/β-轉導素重復序列包含蛋白（SCF/β-TrCP）E3連接酶復合物（21，22）的募集。
2006年發現KEAP1在非小細胞肺癌中發生突變并導致NRF2水平長期升高，首次證明NRF2可能有助于癌癥進展和耐藥性，后來被稱為NRF2的黑暗面（23，24）。這導致了研究高NRF2表達在癌癥中作用的領域發生了轉變，而抑制NRF2可能是治療某些癌癥的前提。另一個與NRF2黑暗面相關的里程碑性發現是自噬功能障礙引起p62依賴性的KEAP1隔離，導致NRF2以一種非正常、不依賴半胱氨酸的方式長時間激活（25，26）。隨著NRF2研究領域的不斷擴大，我們對這條通路復雜性的理解也在不斷推進。
負調節子和激活NRF2的模式
NRF2的調節主要通過控制維持NRF2蛋白水平來實現。三種E3泛素連接酶復合物負責NRF2、CUL3-RBX1-KEAP1復合物、SCF/β-TrCP復合物和HRD1復合物的泛素化和降解。每一種E3泛素連接酶復合物都能在特定亞細胞間室內的不同刺激下調控NRF2的降解。細胞質基質中的CUL3-RBX1-KEAP1復合物響應親電/氧化應激。細胞核或細胞質基質中的SCF/β-TrCP復合物對代謝變化更敏感，由GSK3-β調節。HRD1定位于內質網（ER），并且被證實僅在ER應激期間泛素化NRF2（27）。值得注意的是，其他信號通路、表觀遺傳因子和翻譯后修飾（PTMs）也同樣調節NRF2。此外，通過靶向NRF2的負調控可以實現NRF2通路的激活或抑制（圖2）。
NRF2靶基因
目前已經鑒定出超過250個NRF2靶基因，其參與了多種細胞過程，包括氧化還原調節、I-III相藥物/異生物質代謝、蛋白質穩態、DNA修復、碳水化合物和脂質代謝、鐵穩態、轉錄調節和線粒體功能（圖3）。
氧化還原調控。也許最著名的功能是維持氧化還原平衡，主要是通過谷胱甘肽和基于巰基抗氧化酶的合成和氧化還原循環。例如，負責谷胱甘肽（GSH）從頭合成的谷氨酸-半胱氨酸連接酶（GCL）的催化和調節亞單位（GCLC和GCLM）是NRF2靶基因。此外，利用谷胱甘肽減少過氧化物的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX2和GPX4）、減少氧化態谷胱甘肽的谷胱甘還原酶（GSR）和直接減少過氧化物的過氧氧化還原蛋白（PRDX1和PRDX6）均是NRF2靶基因（28）。通過硫氧還蛋白1和硫氧還蛋白還原酶1（TXN1和TXNRD1）的協同作用減少氧化的蛋白巰基，與通過xCT轉運體（SLC7A11）導入對谷胱甘肽產生至關重要的半胱氨酸，也都由NRF2轉錄調節（28）。
藥物/異生物質代謝。NRF2調節藥物/異生物質代謝的所有三相。參與I相代謝的NRF2靶點的例子是醛酮還原酶家族成員（例如AKR1C1、AKR1B1和ARK1B10）（29）、醛脫氫酶家族成員（例如ALDH1A1、ALDH3A1和ALDH7A1）（30）和NQO1（13），這些酶都參與將毒物/藥物還原為活性代謝物。這使得包括GSTs（例如GSTA1-4和GSTM1-4）（31）和UDP葡萄糖醛酸轉移酶（例如UGT1A1和UGT2B7）（32，33）在內的II相NRF2轉錄靶點分別與GSH或葡萄糖醛酸結合。最后，NRF2還調節III相膜轉運蛋白（ATP結合盒家族成員/多藥耐藥蛋白，例如ABCC1–5和ABCG2）（34，35）的轉錄，而這些轉運蛋白將異生物質/藥物從細胞中排出。
蛋白質穩態。NRF2下游基因通過自噬和泛素-蛋白酶體系統參與維持蛋白穩態。最近發現一些自噬起始蛋白，包括自噬相關（ATG）5和7，以及unc-51樣自噬激活激酶（ULK）1和2，被認定含有AREs（36）。NRF2可直接調節蛋白質翻譯和自噬的主調節子mTOR（37）。此外，p62/SQSTM1作為一種以泛素化蛋白質為靶點進行自噬降解的蛋白質，也是NRF2靶點。NRF2還控制蛋白酶體亞單位[例如蛋白酶體亞單位α1（PSMA1）和蛋白酶體亞單位β5（PSMB5）]（38）以及蛋白酶體成熟蛋白（POMP）（39）的表達，其對蛋白酶體組裝至關重要。
脂質、碳水化合物和鐵代謝。NRF2調節多種葡萄糖和脂肪酸合成代謝所必需的代謝酶。戊糖磷酸途徑酶，包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（PGD）和轉醛酶（TALDO1），在NADPH再生過程中起著關鍵作用，且均為NRF2靶基因（40）。NRF2還調節蘋果酸酶（ME1）和異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）這兩種關鍵三羧酸循環酶的表達（40，41）。脂類分解代謝受NRF2調控，脂肪酶H（LIPH）、磷脂酶A2（PLA2G7）和乙酰輔酶A氧化酶2（ACOX2）（42）均是NRF2的靶點。最后，NRF2通過轉錄血紅素加氧酶1（HMOX1）、膽綠素A和B（BLVRA/B）以及鐵蛋白輕鏈和重鏈（FTH1/FLH1）（43）調節血紅素代謝和鐵穩態。
轉錄調控、DNA修復和阻止凋亡。數種轉錄因子的啟動子內已經鑒定出ARE功能區，包括芳基烴受體（AhR）、神經源性位點Notch同系物蛋白1（Notch1）和視網膜受體α（RXRA），這表明NRF2可以間接控制許多不含ARE的基因的轉錄，以下詳述。NRF2也在DNA損傷修復和阻止凋亡中發揮作用，因為p53結合蛋白1（53BP1）、DNA修復蛋白Rad51同系物1（RAD51）（44）、抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤2（BCL2）和B細胞淋巴瘤特大（BCLXL）（45，46）由NRF2轉錄調節。NRF2靶點的多樣性表明了NRF2在調節細胞功能中的中心作用。
與其他信號通路的串擾
盡管NRF2通過其轉錄靶點直接調節許多細胞反應，但其也可通過與其他主要信號級聯通路的串擾來調節細胞功能。這些通路對應激反應至關重要，包括Notch1、AhR、核因子-κB（NF-κB）、細胞腫瘤抗原p53（p53）、AMP活化蛋白激酶（AMPK）、PI3K-AKT和mTOR，突顯了NRF2在維持細胞存活中的關鍵作用。
Notch信號通路介導胚胎發育過程中的細胞周期和凋亡以及決定細胞命運。NOTCH1基因在其啟動子的近端區域具有ARE功能區，并且Notch信號在NRF2−/−小鼠胚胎成纖維細胞中減弱（47）。NRF2-NOTCH信號軸在肝臟再生過程中至關重要，因為部分肝切除后的NRF2−/−小鼠與野生型小鼠相比肝再生延遲；然而，將這些小鼠與過度表達NOTCH胞內結構域（NICD）的小鼠雜交，完全挽救了NRF2無表型小鼠（47）。相反，NRF2可以通過NOTCH調節，因為在動物的NRF2啟動子區域中，典型NOTCH轉錄所需的RBPjκ序列高度保守。此外，NICD過表達小鼠的NRF2過度活化，表現出與肝特異性KEAP1−/−小鼠非常相似的表型（48）。因此，NRF2和NOTCH之間的相互作用似乎在介導細胞保護，特別是在肝再生的方面起不可或缺的作用。
NRF2信號也與對外源性應激反應的通路重疊。例如，與芳基烴受體核轉運體形成復合物的AhR，可以被多環芳烴（例如二惡英）結合，并從胞質溶膠轉移到細胞核，以調節含異生物質反應元件（XRE）基因的轉錄（49）。NRF2及其一些靶基因，如 GST （50）和NQO1（51），也含有XRE。此外，研究還表明，NRF2可以通過ARE（52）直接調控AhR轉錄，也可以通過巴多酮-咪唑內酯（CDDO-Im；合成，三萜類）的誘導調控AhR靶基因轉錄（53）。
另一個與NRF2雙向相關的主要通路是NF-κB途徑?，F已證明，NF-κB抑制了含有AREs基因的轉錄，因為NRF2和p65/RelA（一種NF-κB轉錄復合物的組成部分）都需要CREB結合蛋白（CBP）來轉錄各自的靶基因（54）。因此，如果p65與CBP結合，會阻止由NRF2驅動的ARE轉錄。有趣的是，幾種NRF2活化劑，包括蘿卜硫素（SF）（55）、甲基巴多酮（CDDO-Me）（56）和姜黃素（57），已被證明能夠抑制NF-κB信號傳導。相反，與野生型小鼠相比，NRF2−/−小鼠在促炎刺激后表現出更多的NF-κB活化跡象（58）。NF-κB激酶β亞單位（IKKβ）的抑制劑作為一種公認的NF-κB負調節因子，已證明被CUL3-RBX1-KEAP1復合物（59）泛素化和降解。最后，幾個NRF2靶基因，如NQO1、TRX1和HMOX1，已經被證明可調控NF-κB驅動的轉錄，這表明這些通路在上下游水平（60）發生交叉。
NRF2直接與p53/p21級聯相互作用，而p53/p21級聯是抗癌治療的重要靶點，其調節細胞凋亡。具體來說，NRF2和p53的共表達導致多種細胞系（61）中SLC7A11、NQO1和GST的抑制。研究表明，NRF2可以調控p53的負調節因子E3泛素蛋白連接酶MDM2的表達，表明NRF2可以直接調控p53的活性（62）。此外，p21（CDKN1A），一種參與細胞周期、凋亡和分化調節的p53靶基因，直接與NRF2的DLG和ETGE模體結合，從而穩定和轉錄含ARE的基因（63）。NRF2和p53之間的相互作用被以下事實進一步證明，即NRF2−/−；p53+/−小鼠比其NRF2−/−或p53+/−小鼠（64）更容易受到亞硝胺誘導的致癌作用，其表明NRF2和p53在介導應激期細胞生存方面至關重要。
NRF2也與對新陳代謝變化作出反應的關鍵通路相互作用。例如，AMPK，一種通過AMP:ATP比率來檢測細胞整體能量狀態的傳感器，磷酸化NRF2的S550處，增強其核易位（65）。同樣地，β-TRCP降解NRF2所必需的GSK3-β可被PI3K-AKT信號軸（66）或mTOR（67）磷酸化，這表明NRF2的穩定性可以由這兩個通路決定。也有研究表明，mTOR磷酸化p62/SQSTM1，增強其與KEAP1的相互作用，導致p62-KEAP1復合物的自噬降解和NRF2的上調（68）?？偟膩碚f，NRF2與數個決定了細胞生長和存活的關鍵信號級聯相互作用。
NRF2調節的其他模式
NRF2信號通路的表觀遺傳控制，以及影響NRF2表達的KEAP1和NRF2/NFE2l2中幾個單核苷酸多態性，已在癌癥背景下被廣泛研究。啟動子甲基化調節NRF2和KEAP1，以及幾個NRF2靶基因的表達，包括GST、NQO1、GPX和UGT1A1（69）?；熆梢越档蚇RF2啟動子的甲基化，例如在耐藥結腸癌中5-氟尿嘧啶（5-FU）可誘導活性氧物種（ROS）生成，導致NRF2啟動子的低甲基化，升高NRF2水平（70）。NRF2活性可受KEAP1啟動子的高甲基化影響，導致NRF2的表達增加。并不是所有的表觀遺傳修飾都能增強NRF2的活性，例如晚期前列腺癌中NRF2啟動子的高甲基化抑制NRF2（71）。組蛋白的乙?；?去乙?；图谆?去甲基化，以及microRNAs，也被證明影響NRF2的激活（69）。需要更多的研究來確定潛在表觀遺傳靶點來調節疾病中的NRF2通路。
除了泛素化和磷酸化NRF2的Neh2和Neh6結構域中關鍵殘基調控其穩定性外，NRF2還可以通過其他幾種PTMs（post-translational modifications，翻譯后修飾）進行修飾，包括甲基化、乙?；皖惙核鼗揎?。通過p300/CBP乙?；疦eh1結構域的關鍵賴氨酸殘基增強其DNA結合能力，可提高NRF2的活性，且去乙?；?2）能逆轉。NRF2在R437位點上的甲基化也影響其轉錄活性（73）。如前所述，NRF2的磷酸化導致其降解；然而，其他絲氨酸殘基（s40、s215、s408、s550和s577）也可被數種上游激酶磷酸化（65、74、75）。盡管NRF2轉錄活性的影響可能取決于激酶/絲氨酸組合，但這些絲氨酸殘基的磷酸化被認為增加了NRF2向細胞核的易位。另一種確認的NRF2的PTMs是類泛素化修飾，它增強了HepG2細胞（76）中NRF2的泛素化和降解，而在胰腺β-胰島細胞中，它增強了NRF2活性并促進了細胞存活（77），表明了NRF2的PTMs的細胞類型-特異性相關性。
靶向NRF2用于疾病
調控NRF2預防和治療癌癥和其他慢性疾病
在NRF2研究領域有一個正在發展的主題，即疾病條件下依賴于環境和時間的靶向NRF2。利用藥物活化NRF2的有益作用仍然是基于NRF2化學預防和干預其他慢性疾病的一個重要方面，如神經退行性病變、糖尿病、心血管疾病以及慢性腎臟和肝臟疾病。然而，越來越多的研究表明，在某些癌癥和疾病階段，NRF2水平已經很高，這表明也應考慮設計減輕與延長NRF2活化相關的潛在有害或轉化效應的藥物。圖4總結了當前NRF2活化劑和抑制劑以及疾病中NRF2表達水平的示例。
NRF2用于化學預防。迄今為止，已有數百項研究評估了激活NRF2的化合物（78，79）的體外和體內化學預防性能。重要的是，大多數化學預防化合物（或其生物活性代謝物）是親電試劑，并通過對半胱氨酸的修飾激活NRF2，盡管結合KEAP1的Kelch結構域的肽和小分子也已被開發（80）。迄今為止，蘿卜硫素（天然，異硫氰酸酯）、CDDO-Me（合成，三萜類）、RTA 408（合成，三萜類，奧馬維洛酮）和富馬酸二甲酯（DMF；合成，Tecfidera）是僅有的進入美國臨床試驗的NRF2活化劑，只有Tecfidera被批準用于治療多發性硬化癥（MS）。顯然，基于NRF2的安全、有效和特定療法的發展仍然是癌癥預防的一個探索領域。然而，關于使用NRF2活化劑可能促進NRF2黑暗面并支持先前存在腫瘤的進展，這一點仍存在爭議。因此，根據NRF2水平和癌癥分期，目標人群和給藥方案應非常仔細地定時和規劃。
組成性NRF2在癌癥中的激活。考慮到NRF2的生存優勢，癌細胞劫持NRF2通路并不奇怪。Kelch或KEAP1介導區域的突變降低了其與NRF2的相互作用，導致肺癌細胞系和組織的組成性活化（81）。此外，KEAP1中的一些體細胞突變以及野生型等位基因雜合子的丟失，提高了NRF2水平并產生了耐藥性（23）。重要的是，研究證實，在肺腺癌中，KEAP1的突變頻率與TP53相同，而在肺鱗癌中，KEAP1和NRF2是突變頻率最高的基因（82，83）。據癌癥基因組圖譜項目報告，超過30 %的鱗狀細胞癌病例（84例）中KEAP1與NRF2發生突變和拷貝數改變，以及CUL3的缺失或突變。研究還發現，由于CUL3缺失或啟動子甲基化，RBX1的表達降低（85，86）。表1總結了導致NRF2組成性激活的機制以及觀察到的癌癥類型。
表1 NRF2通路基因的遺傳改變導致NRF2高表達和其所對應的腫瘤類型。
NRF2抑制劑在克服癌癥抵抗中的作用。從天然產物提取物的篩選結果中發現了第一種NRF2抑制劑，Brusatol（天然，類西林類）（105）。Brusatol通過降低NRF2及其靶基因的蛋白質水平，使一些癌細胞系對化療藥物敏感（105）。在異種瘤移植模型中，Brusatol與順鉑聯合使用可提高肺癌細胞的化療敏感性，在小鼠肺癌模型（LSL-KrasG12D/+）（105）中提高了腫瘤總負荷。盡管最近的兩份出版物已經確定了Brusatol是一種全局翻譯抑制劑（106，107），但它仍是研究NRF2在癌癥化學增敏中的抑制作用的有用工具，因為諸如NRF2等短壽命蛋白最容易受到蛋白質翻譯抑制。氟哌酮（人工合成，生物堿）也已被證明通過抑制全局蛋白質翻譯使依賴于氟哌酮的癌細胞對抗癌藥物敏感（108）。
其他的NRF2抑制劑包括：ARE表達調節劑1（AEM1），一種具有未知作用機制的小分子抑制劑（109），和ML385，一種結合到NRF2的Neh1結構域的分子，阻止NRF2同MAFG二聚與結合ARE的過程（110）。ML385是目前最有趣的抑制劑，但它有一個意料之外的作用，即導致NRF2的mRNA和蛋白質水平呈劑量和時間依賴性的顯著下降。這種下降不太可能是直接抑制與ARE的結合，因此需要進一步調查。沒有精確定義作用模式的負向調節NRF2活性的其他天然產物包括：甘露酮（111）、馬拉巴尼酮A（112）、赭曲霉素A（113）和沃戈寧（114）。此外，由于核受體可直接結合NRF2并抑制其激活活性，一些研究提出地塞米松/布地奈德（糖皮質激素受體激動劑）和全反式維甲酸（ATRA；維甲酸受體激動劑）作為NRF2抑制劑（115）。然而，這些化合物的主要靶點是核受體而不是特定的NRF2，因此這些靶點不太可能作為NRF2靶點療法開發。
神經退行性病變中的NRF2。與癌癥相似，NRF2在神經退行性疾病中的作用是復雜的。有趣的是，NRF2的表達減少與神經干細胞功能（116）隨年齡相關下降有關，并且NRF2對氧化應激的反應也隨著年齡增長而降低（117）。在神經退行性病變過程中，NRF2可以被激活或抑制，這取決于受影響的細胞類型和疾病的階段。例如，一些研究表明，在阿爾茨海默?。ˋD）患者的大腦中，NQO1和HMOX1減少，而另一些研究表明，NRF2仍然局限于細胞質基質，導致靶基因表達降低（118）。在活動的巨噬細胞和星形膠質細胞中，NRF2和NQO1表達升高，但在非活動的巨噬細胞和星形膠質細胞以及MS病變中，NQO1、HMOX1和PRDX水平持續升高，并且在帕金森?。≒D）患者的黑質中觀察到NRF2的核定位（118）。相反，肌萎縮側索硬化患者的初級運動皮層和脊髓中的NRF2蛋白水平降低（119）。這些差異可能是特定于細胞類型和大腦區域的，但也可能是由于所調查疾病階段的結果。由于NRF2通路的反應性隨著年齡增長而降低，NRF2可能在疾病早期激活，在疾病后期下降。
一些NRF2的藥理活性劑改善神經退行性表型。巴多酮甲酰胺（合成，三萜類，CDDO-MA）已被證明能改善轉基因AD小鼠的記憶，減少淀粉樣β斑塊的形成（120）。同樣，葛根素（天然，植物雌激素）、蘿卜硫素、葒草苷（天然，黃酮）和黃芩苷（天然，黃酮）改善了AD表型（121-124）。3H-1,2-二硫醇-3-硫酮（天然，二硫雜茂硫酮，D3T）和巴多酮乙酰胺/三氟乙酰胺（合成，三萜類，CDDO-EA/TFEA）可保護野生型小鼠，但不保護NRF2−/−小鼠和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的PD小鼠（125，126）。DMF是目前唯一通過三期臨床試驗治療多發性硬化癥的NRF2激動劑；然而，最近使用蘿卜硫素、CDDO-TFEA和苦參堿（天然生物堿）的研究顯示，它們惡化小鼠表型（127-129）。令人好奇的是，DMF是該組中唯一一種獲得美國食品藥品監督管理局批準的藥物，盡管它不是最有效的NRF2激動劑，這可能是由于NRF2不依賴于免疫調節（130）、與其他途徑的協同作用，或者NRF2激活的程度取決于疾病背景。
NRF2在糖尿病中的雙重作用。在I型和II型糖尿病中也證實了NRF2的失調。氧化應激增加是糖尿病的一個普遍特征，它導致許多組織的細胞功能障礙和代謝變化。然而，與癌癥和神經退行性病變中的NRF2相似，NRF2在糖尿病中作用復雜，其取決于組織和細胞類型。在鏈脲佐菌素誘導的I型糖尿?。?31）小鼠模型中，SF和肉桂醛（CA，天然，黃酮）均能抑制氧化損傷并恢復正常腎功能?？诜﨏DDO-Im可增強db/db小鼠的NRF2活性，降低糖尿病表型（132）。CDDO-Im、CDDO-Me、奧替普拉和姜黃素改善了遺傳性與高脂肪飲食誘導的糖尿病2種模型（133-136）中的胰島素敏感性和葡萄糖耐受性。
有趣的是，具有較高NRF2組成水平的KEAP1flox/−小鼠與db/db小鼠（132）雜交時，也表現出延遲糖尿病發作；然而，其他研究表明，KEAP1基因敲除增強了Lepob/ob小鼠和高脂肪飲食（137，138）小鼠的糖尿病表型，這表明飲食和遺傳因素導致了糖尿病的發生?？刂芅RF2可能對糖尿病的發病和進展有不同的影響。CDDo-Me被證明能增強糖尿病腎病患者的腎功能并減輕其體重（139）；然而，由于心血管事件的風險增加，該研究被終止。重要的是，改進特異性和適當的臨床環境仍然可以為這類和其他基于NRF2藥物（140）產生積極的結果。
NRF2在心血管、腎臟和肝臟疾病中的作用。心血管疾病包括從高血壓到冠狀動脈疾病的各種疾病。與其他慢性疾病一樣，許多心血管疾病的進展可能需要幾十年。心血管疾病的一個常見特征是增加對內皮細胞和心肌細胞的氧化損傷，其可引起心臟功能失常，心臟和血管系統的慢性損傷，導致心力衰竭。蘿卜硫素、t-BHQ、MG132、白藜蘆醇和α-脂肪酸對NRF2的藥理學激活，被證明可以挽救心力衰竭的大鼠（141）。相反，αB晶體蛋白突變的心肌肥大小鼠模型中NRF2慢性激活導致還原性應激（142），這表明NRF2的受控激活可以預防心臟功能障礙，而延長激活可能會導致有害影響。
慢性氧化應激和炎癥也是慢性腎?。–KD）和慢性肝病的常見特征。至少對于沒有心臟危險因素的患者，CDDO-Me仍然是最有希望的治療方法，已達到臨床試驗階段（143），并且CDDO-Im已證明可預防藥物誘導的肝損傷，并減少非酒精性脂肪性肝病模型（144）中的肝臟脂肪積累。這些研究表明，在與慢性炎癥和ROS產生相關的疾病中，NRF2的激活可保護機體免受氧化應激；然而，延長NRF2通路的激活可導致代謝變化，引起還原應激促進疾病進展。
靶向NRF2的臨床試驗和基于NRF2療法的藥物重新定位
如上所述，幾種NRF2活化劑已開始臨床試驗，以治療多種病理；然而，只有DMF已被批準用于治療復發性MS。目前最流行的一種方案是膳食補充蘿卜硫素，測試對慢性阻塞性肺?。–linicalTrials.gov Identifier NCT01335971）（145）、暴露于臭氧和其他空氣污染物（NCT01625130, NCT01437501）（146，147）、囊性纖維化（NCT01315665）、哮喘（NCT01845493）、鐮狀細胞?。∟CT01715480）（148）的治療，頭頸癌（NCT03182959，NCT03268993和NCT03402230）療效有限或尚未報告。最近的幾項臨床試驗還測試了蘿卜硫素對自閉癥譜系障礙（NCT0256148）和精神分裂癥（NCT01716858）（149）相關癥狀的治療，以及在II型糖尿病患者中正進行一項研究（NCT0281448）。有趣的是，局部蘿卜硫素在保護皮膚免受紫外線相關損傷方面進行了測試（NCT03126539）。其他的NRF2活化劑也在研究中，如姜黃素治療晚期糖尿病腎?。∟CT03262363），以及最近完成的白藜蘆醇治療慢性腎?。∟CT02433925）的試驗。RTA 408對線粒體肌病患者（NCT0225422）和弗里德賴希共濟失調患者（NCT02255435）的試驗正在進行。
藥物重新定位的想法也越來越受歡迎。最近的兩個例子是DMF治療PD（150）和Bardoxolone治療鐮狀細胞?。?51）和肺動脈高壓（NCT02036970）。利用藥物化學方法衍生已有的治療方法來提高其特異性和療效是另一種有趣的可能性。此外，最近研究趨勢向非親電小分子NRF2-KEAP1相互作用的調節劑轉變，以減少脫靶效應（80）。研究目的應該是發現新的療法和優化目前的方法。
總結要點
1、NRF2與病理狀態之間關系復雜，開發有效治療方法之前需要仔細評估。
2、通過靶向NRF2的負調節子，可以激活NRF2途徑。
3、抑制NRF2途徑已被證明是一種挑戰，最有希望的策略是干擾NRF2-sMAF-ARE結合。
4、NRF2通過AREs直接或間接調控其他轉錄因子控制多個轉錄靶點，表明其在細胞存活中的核心作用。
5、激活NRF2在實驗性疾病模型中顯示出巨大的成功；然而，許多癌癥/代謝性疾病的NRF2水平長期升高，表明在某些情況下需要靶向NRF2抑制劑。
6、盡管有幾種NRF2活化劑已用于臨床試驗，但只有DMF被FDA批準用于治療MS。
7、通過現有藥物的用途改變或衍生化，重新定位NRF2療法可能會增加基于NRF2療法的數量。
未來問題
1、我們如何縮小從實驗室到臨床治療間的距離？盡管過去20年的研究已經清楚地表明了NRF2在疾病中的雙重作用，但臨床批準的治療方法的數量僅限于DMF。
2、在疾病中靶向NRF2的正確時機是什么？NRF2的有益或有害激活與時間和疾病背景有關，這對發展基于NRF2的治療方案提出了重大挑戰。
3、為什么激動劑間存在差異？已報道了多種NRF2激動劑，但它們顯示了ARE調控基因的差異激活和疾病相關效應，可能是由于與其他調節模式的協同效應。
4、能開發出特定的NRF2抑制劑嗎？需要NRF2的靶向抑制劑，因為目前的選擇已顯示出脫靶效應。
本文由福山生物整理翻譯，轉載請明確注明出處。
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