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NRF2和KEAP1在慢性疾病中的治療靶向性
發表于：2019-04-02 作者：admin 來源：本站 點擊量：6149
Therapeutic targeting of the NRF2 and KEAP1 partnership in chronic diseases. Nat Rev Drug Discov. 2019 Jan 4. doi: 10.1038/s41573-018-0008-x. [Epub ahead of print] Review. PubMed PMID: 30610225.
摘要：轉錄因子NF-E2 p45相關因子2（NRF2;由NFE2L2編碼）及其主要負調節因子，E3連接酶受體Kelch樣ECH相關蛋白1（KEAP1）是維持氧化還原、代謝和蛋白質穩態以及炎癥調節的關鍵。因此，激活NRF2可對多種疾病起到細胞保護作用，包括肺和肝的慢性疾病、自身免疫病、神經退行性疾病和代謝性疾病以及癌癥啟動。一種NRF2激活劑已獲得臨床批準，并且基于半胱氨酸傳感器KEAP1的幾種親電修飾劑及其與NRF2相互作用的抑制劑目前正在臨床開發中。然而，在靶向特異性、藥效學特性、療效和安全性方面仍存在挑戰。
前言
轉錄因子NF-E2 p45相關因子2（NRF2;由NFE2L2編碼）于1994年作為人類cap 'n' collar（CNC）堿性區域亮氨酸拉鏈轉錄因子家族成員被發現（1）。隨后的研究，包括NRF2敲除小鼠的產生，確定NRF2調控約250個基因的表達，調控的基因在其啟動子調節區中含有增強子序列，稱為抗氧化應答元件（ARE）（2, 3）。這些基因編碼一個合作酶網絡，參與內生和外生生物轉化反應、抗氧化代謝、碳水化合物和脂類的中間代謝、鐵的分解代謝、蛋白質降解和炎癥調節（4）。通過這個轉錄網絡，NRF2能夠協調多方面應對各種形式的應激，維持穩定的內部環境。
1999年，Kelch樣ECH相關蛋白1（KEAP1）被鑒定為NRF2的抑制因子（5），又過了5年才被報道為E3泛素連接酶底物適配器，靶向NRF2進行蛋白酶體的快速降解（6-8）。因此，KEAP1確保在無應激條件下，NRF2是低豐度的蛋白質，具有僅約15-40分鐘的有限半衰期，這取決于細胞類型。然而，重要的是，KEAP1含有幾個高活性的半胱氨酸，經親電子分子修飾后，可防止其靶向NRF2進行蛋白酶體降解，從而導致NRF2蛋白在氧化還原應激下快速核聚集，并在與小肌肉筋膜纖維肉瘤癌基因同源蛋白（sMAF）二聚化后，通過NRF2-sMAF誘導含有ARE的基因（9,10）。
現在人們普遍認識到，由于NRF2-靶基因編碼的蛋白質的多功能和全面的細胞保護作用（包括抗氧化、解毒和抗炎），因此，NRF2-KEAP1信號通路對于預防以氧化應激和炎癥為基礎病理特征的多種疾病至關重要。這些疾病包括代謝、炎癥和自身免疫性疾病，肺、肝、腎、胃腸道和心血管系統疾病以及神經疾?。?, 11）。NRF2在這些非腫瘤性疾病中的保護作用的實驗證據將在本綜述的后面討論。我們還討論了NRF2在癌癥中的作用，這是一個需要深入研究的問題（12）。
通過單粒子電子顯微鏡獲得的KEAP1二聚體3D重建顯示，該蛋白具有叉狀莖結構，包括兩個大球體，它們包圍了中間區域（IVR）、Kelch和羧基末端結構域，而二聚化由BTB域介導（圖1a）（13）?？紤]到KEAP1包含許多不同且自主運作的半胱氨酸傳感器（C151、C226、C273、C288和C613）（14-16），現有證據表明，NRF2和KEAP1整合了一氧化氮、Zn2+、烯醛信號傳導與氧化還原信號傳導一起提供了一種可能至少部分進化的機制，以允許快速適應飲食中遇到的植物化學物質。許多植物來源的親電異種生物激活NRF2-KEAP1信號通路以引發細胞保護反應，KEAP1中的高活性半胱氨酸起直接傳感器的作用（17-19）。這些傳感器與親電子試劑的高反應性使得KEAP1在沒有非特異性硫醇修飾的情況下進行靶向治療成為可能（圖1b）。因此，已經描述了許多天然存在的NRF2靶基因誘導劑（20），并且新的誘導劑在不斷被發現。
盡管大量學術實驗室參與了NRF2激活劑的鑒定，但從歷史上看，制藥公司在這個令人興奮和充滿希望領域的參與度卻相當低。業界之所以不愿將NRF2-keap1信號通路視為有價值的藥物靶點，部分原因可能是其廣泛的生物化學活性，而不僅僅是控制由NRF2直接或間接調控的抗氧化系統。NRF2激活劑的各種直接和間接效應有時被解釋為非特異性效應的證據。然而，KEAP1中幾種不同的基于硫醇的氧化還原開關的進化允許哺乳動物適應廣泛的植物化學物質，這為改變NRF2的激活引起某些“脫靶”效應并采用更廣泛視野的觀念提供了理論基礎。NRF2的激活產生有益的“多靶點”細胞保護作用（11）。尤其是NRF2激活的多靶點效應包括維持氧化還原信號、增強異種生物轉化、控制和解決炎癥、抑制糖異生和肝脂肪生成、支持蛋白穩定和抑制纖維化（9）。在這方面，值得注意的是，大多數慢性疾病，特別是老年人的慢性病，沒有獨特的病因學，也沒有單一的病理表型，因此，它們可能通過激活NRF2的藥物得到最有效的治療。事實上，與更有針對性的治療干預相比，NRF2激活后廣泛的細胞保護機制的刺激不太可能被致病過程有效地淹沒或規避。
這種對NRF2作為潛在藥物靶標的廣泛認可引起了制藥業的興趣，并導致對NRF2調節劑臨床開發的大量投資（21）。NRF2激活劑富馬酸二甲酯(DMF;目前，商標名如Fumaderm或Tecfidera)已被臨床用于治療銀屑病和復發性多發性硬化癥(MS)(表1)，其目前的分布情況仍是其他制藥公司希望達到的目標。目前，多種不同化學類型的NRF2激活劑處于臨床開發的不同階段，如靶向KEAP1半胱氨酸的富馬酸衍生物、異硫氰酸硫蘿卜硫素(SFN;4‐異硫氰酸甲酰丁酯)、氰烯酮三萜、硝基脂肪酸和羥胺。其他候選藥物包括破壞NRF2-KEAP1蛋白-蛋白相互作用(PPIs)的非親電化合物，以及具有keap1獨立作用模式的分子。NRF2的抑制劑也在研究中，但尚未進行臨床試驗。本綜述概述了這些候選藥物，并強調了針對NRF2-KEAP1信號通路不尋常的性質和至關重要的意義。本文描述了NRF2在細胞氧化還原、代謝和蛋白穩態以及炎癥調控中的生理作用，并為NRF2在非腫瘤性疾病中的保護作用提供了實驗證據。評價了目前臨床開發的各種小分子NRF2活性藥理調節劑的優缺點。最后，強調了與NRF2調節劑開發相關的持續挑戰，包括靶點特異性、藥效學評估、生物利用度、有效性和安全性。
NRF2-KEAP1信號通路的生理作用
氧化還原、代謝和蛋白質穩態
自從其最初被發現參與生物轉化反應，調節某些細胞色素P450氧化還原酶、結合酶和ABC轉運蛋白的表達（表2），NRF2參與控制細胞內氧化還原環境的作用變得越來越明顯，最終將NRF2-KEAP1信號通路識別為“硫醇驅動的總開關”用于“整個系統范圍的氧化應激反應”（22）。NRF2調控參與NADPH生成的4個基因(葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、蘋果酸酶1和異檸檬酸脫氫酶1)的表達（23–26）。這種還原當量的供應進一步被大量氧化還原反應所利用，其中許多氧化還原反應也受到NRF2的調節。因此，NRF2調控氧化還原緩沖物還原型谷胱甘肽(GSH;其氧化形式為GSSG)，如谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶和數個谷胱甘肽s -轉移酶的催化和調節亞基（4）。此外，氧化還原蛋白家族中的許多輔助蛋白，如硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、過氧化物還蛋白和硫還蛋白，都受到NRF2的調控，提供區域活性氧生成的區域化傳感和信號轉導（ROS;即過氧化氫（H2O2）羥基和超氧自由基 ）（27-29）。除了這些對氧化還原狀態的直接影響外，NRF2還調節編碼酶的基因，這些酶可阻止醌參與氧化還原循環反應和谷胱甘肽耗竭（通過NAD(P)H:醌氧化還原酶1（NQO1））或參與間接生產膽紅素（血紅素加氧酶1（HMOX1）和膽綠素還原酶（BVR）），是最有效的非極性生理抗氧化劑（30）。最后，NRF2通過與戊糖磷酸途徑和糖酵解的相互作用，影響中間代謝，增加底物的可用性，減少線粒體呼吸鏈的等效物（31），并維持線粒體DNA （mtDNA）的完整性（32）。
NRF2在氧化還原改變或營養缺乏期間參與清除氧化或其他損傷的蛋白質和細胞器。因此，自噬轉運蛋白泛素結合蛋白p62(由SQSTM1編碼)是NRF2的轉錄靶點，它通過其泛素關聯域(UBA)與泛素化產物相互作用，并通過其LC3相互作用的基序將其招募到自噬體中（33, 34）。此外，KEAP1與p62結合（33, 35），最近的一項研究發現KEAP1-CULLIN 3（CUL3）在其UBA結構域中的K420位點泛素化p62，從而促進p62的螯合活性（36）。在其一級結構中，p62含有ETGE樣基序STGE，在被mTORC1磷酸化后產生識別位點與KEAP1對接（37）。然后，KEAP1被轉運到自噬體降解，從而使NRF2積累（38）。此外，一些自噬基因似乎在其啟動子區域含有序列，有報道稱NRF2同時激活伴侶介導的自噬（39）和巨自噬（40，41）。NRF2在氧化條件下在蛋白質穩態中的其他作用通過未折疊蛋白質反應的激活（42,43）及其調節蛋白酶體亞基表達的能力來證明（44,45）。
至少在腦和血液中，編碼NRF2的mRNA豐度高于KEAP1的mRNA（圖2）；相反，KEAP1蛋白的半衰期比NRF2的半衰期長（表2）。這些觀察結果強調了兩種蛋白質的不同轉換率——KEAP1緩慢，NRF2快。此外，盡管NRF2和KEAP1普遍表達，但特定細胞類型主要負責穩態適應并呈現不同的表達水平（圖2）。因此，單核細胞和嗜中性粒細胞在血細胞中表現出最高水平的NRF2，表明先天免疫系統的免疫調節作用（見下文）。在大腦中，星形膠質細胞和神經元之間的相互作用將中間代謝與氧化還原穩態結合起來，至少部分通過NRF2實現（46）。此外，神經元中的谷氨酸能神經傳遞導致產生由神經元GSH池控制的ROS。當該池濃度較低時，鄰近的星形膠質細胞通過向神經元提供GSH前體甘氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺和半胱氨酸來促進其恢復（47）。毫不奇怪，星形膠質細胞中NRF2水平很高（圖2）。此外，與神經元相比，小膠質細胞作為單核細胞譜系的一部分表達高水平的NRF2。
控制炎癥
NRF2在單核細胞和粒細胞中含量豐富(圖2)，提示NRF2參與了這些細胞類型驅動的免疫應答。敲除NRF2的小鼠對敗血癥休克高度敏感（48），并且在創傷愈合過程中表現為持續性炎癥（49, 50）。而NRF2的基因或藥理激活抑制了促炎細胞因子的產生（51 - 56）。在人類細胞中，KEAP1的破壞通過減弱髓系白細胞（57）和巨噬細胞（58）的炎癥反應來預防敗血癥。特別有趣的是，NFE2L2中的一個多態性與轉錄活性降低相關，與炎癥性腸病(IBD)（59）和慢性胃炎（60）風險增加相關。如下所示，NRF2的強抗炎活性至少可歸因于三個獨立的機制：氧化還原代謝的調節；與核因子-κB(NF-κB)的相互作用；對促炎基因的直接調控。
炎癥與局部和全身病理水平的ROS積累增加有關，這可能損害氧化還原信號（61）。線粒體功能障礙和NADPH氧化酶不受控制的激活是炎癥細胞中ROS生成升高的主要因素，線粒體ROS引起mtDNA損傷和釋放，從而形成惡性循環，進一步ROS的產生和炎性小體的激活，最終導致器官功能衰竭（62）。NRF2的氧化還原調節活性是阻止炎癥惡化和隨后組織損傷的惡性循環中的重要突破（63）。
NF-κB和NRF2相互作用。幾個NF-κB功能結合位點已確定在NFE2L2基因啟動子區（64）。另一方面，NRF2抑制NF-κB轉錄活性。用脂多糖（LPS）或TNF處理NRF2缺陷小鼠增加了NF-κB轉錄的表達，表明NRF2對NF-κB的抑制作用（48）。該發現的可能解釋是NF-κB抑制劑（IκB）在NRF2缺陷細胞中高度磷酸化并且經歷快速蛋白酶體降解，從而減少對NF-κB的抑制（48）。此外，LPS顯示同時激活NF-κB介導的快速反應和NRF2介導的緩慢反應，最初的促炎反應由NF-κB驅動，然后當NRF2活性最大時隨后被抑制（65）。NRF2-KEAP1信號通路抑制NF-κB信號傳導的其他機制包括NRF2和p65之間與p300競爭性結合（66）和KEAP1對IκB激酶-β（IKKβ）的降解（67, 68）。
幾種巨噬細胞特異性基因含有ARE序列，因此受NRF2調節。這些包括MARCO（細菌吞噬作用所需的受體）和CD36（氧化低密度脂蛋白的清道夫受體）（69, 70）。 另一方面，NRF2以不依賴ARE的方式結合編碼IL-6和IL-1β促炎基因調節區，并阻止RNA聚合酶II開始轉錄募集（52）。
最近的研究表明巨噬細胞代謝與NRF2引起的抗炎反應有關。線粒體代謝物亞甲基丁二酸是由三羧酸循環在促炎刺激下產生的，在巨噬細胞活化過程中會顯著增加（71, 72）。反過來，亞甲基丁二酸烷基化幾個KEAP1半胱氨酸傳感器，包括關鍵C151、C273和C288殘基，從而激活NRF2并抑制促炎細胞因子如IL-6和IL-1β的轉錄（71）。因此，亞甲基丁二酸是KEAP1的內源性調節劑，在炎癥的控制過程中起到“關閉開關”的作用。此外，通過細胞可滲透的亞甲基丁二酸衍生物4-octylitaconate或SFN激活NRF2，通過降低mRNA穩定性來抑制干擾素基因(STING)的銜接子分子刺激物的表達，從而抑制I型干擾素(IFN)的產生（73，74）。
NRF2-KEAP1信號通路和非腫瘤性疾病
在細胞和動物模型中已經發現了大量關于NRF2對多種慢性疾病保護作用的信息，許多研究使用了NRF2敲除小鼠（75）。關于人類，最近的一項研究為使用系統醫學方法分析NRF2對抗慢性病奠定了基礎，并且基于NRF2與其他分子（NRF2相互作用組）的連通性以及經驗證據，建立了第一個NRF2相關疾?。∟RF2病變）的圖譜（9）。NFE2L2的功能性遺傳變異與疾病風險之間的關聯研究不斷提供有關NRF2在確定人類對慢性病易感性中作用的令人信服的證據。此外，這些遺傳學研究支持這樣一種假設，即對于NFE2L2的某些功能變化，模仿NRF2表達的微小變化的藥物可能具有治療價值。下面，我們將簡要描述NRF2參與人類慢性疾病的一些里程碑性的成果，并重點介紹現有的遺傳學證據。
自身免疫性疾病
氧化組織損傷和細胞凋亡導致半抗原或受損大分子的形成，增加了自身免疫反應的風險。由于NRF2調節的酶在許多化學物質的解毒中起著關鍵作用，因此它提供了一種保護機制，防止對自身免疫發病機制的環境易感性（79）。此外，NRF2抑制促炎T輔助細胞1（TH1）和TH17細胞反應并激活免疫抑制調節性T細胞（Treg）和TH2細胞（80）。NRF2在自身免疫中的相關性已經在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中進行了廣泛研究，其是MS的小鼠模型，MS是一種慢性炎性疾病，其特征在于自身反應性免疫細胞浸潤到中樞神經系統中。在EAE小鼠模型中，NRF2的缺乏加劇了疾?。?1），而KEAP1的敲低（52）或用一系列NRF2激活劑（包括氰基三萜類化合物和SFN）（82,83）治療減弱了其嚴重性。在人類中，通過IFNβ治療患者基因表達譜確定NRF2是長期抗氧化反應和神經元保護的潛在介質（84）。如下所述，一些生物制藥公司正在利用強有力的證據表明NRF2的活化在MS中具有治療價值。事實上，迄今為止唯一獲得美國食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）DMF批準的NRF2激活劑正在由Biogen銷售，用于治療緩解復發型MS和銀屑?。?5）。NRF2的保護作用已被建議用于其他自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡（86, 87）、干燥綜合征（86）、類風濕性關節炎（88, 89）、白癜風（90-92）和STING依賴性干擾素?。?4）。
呼吸系統疾病
肺通過釋放促炎細胞因子和趨化因子對包括煙霧在內的各種環境毒物作出反應。這一主要效應通過循環單核細胞、中性粒細胞和T細胞的募集產生漸進的低度炎癥反應，這些細胞釋放額外的炎癥介質、ROS和金屬蛋白酶。最終結果是肺實質受損的惡性循環，導致慢性阻塞性肺?。–OPD）或肺氣腫（93）。NRF2減輕由ROS和炎癥引起的肺實質負擔。香煙煙霧是COPD和肺氣腫發展的主要危險因素。
NFE2L2-/-小鼠對香煙煙霧引起的肺氣腫的發展比野生型更敏感（94）。此外，長期暴露于香煙煙霧后肺氣腫的發展與細胞保護基因的表達下降有關（95），而五環氰基酮CDDO-咪唑啉保護NFE2L2+/+小鼠對抗香煙煙霧誘導的氧化應激、肺泡細胞凋亡、肺泡破壞和肺動脈高壓，而不是NFE2L2-/-小鼠（96）。NRF2的遺傳上調（通過Clara細胞中的Keap1缺失，其在鼠上呼吸道中是豐富的）具有類似的保護作用（97）。
在人類中，與沒有肺氣腫的患者相比，吸煙相關肺氣腫患者的肺泡巨噬細胞中NRF2轉錄信號降低（98）。人類NFE2L2基因啟動子包含一個含有三個單核苷酸多態性(SNP)序列的單倍型和一個調控NRF2表達的三重重復多態性。具有低至中等啟動子活性的COPD患者更容易發生呼吸衰竭（99）。SFN對NRF2的藥理學激活，或一種干擾KEAP1與NRF2相互作用的化合物，逆轉培養肺泡巨噬細胞和從COPD患者中分離的單核細胞來源巨噬細胞受損的細菌吞噬作用（70,100）。然而，每日口服一定劑量SFN(西蘭花芽苗提取物)的慢性阻塞性肺病患者并沒有導致NRF2依賴性基因表達或肺泡巨噬細胞和支氣管上皮細胞炎癥標志物的一致性變化（101），說明將細胞培養研究結果轉化為人類結果的一些挑戰。其他慢性肺病，如特發性肺纖維化、慢性結節病和過敏性肺炎，被發現在支氣管肺泡灌洗液中表現出NRF2表達增加和內源性抗氧化劑水平增加，表明對病理性ROS水平的適應性反應不成功（102）。
胃腸疾病
胃腸道經常受到外來生物的挑戰，這可能導致形成病理水平的ROS，并可能引發IBD（103）。胃腸道也是膳食及其合成類似物在藥理學上激活NRF2的重要部位之一（23, 104-106）。在小鼠中，右旋糖酐硫酸鈉(DSS)誘導的實驗性結腸炎在NRF2缺陷小鼠中引起的IBD要比野生型小鼠嚴重（107）。在人類中，NRF2在腸細胞對炎癥應激適應的相關性在IBD患者的一項全面轉錄組研究中得到證實，證明了NRF2在減弱腸道巨噬細胞應激反應中的作用（108）。重要的是，在一組日本患者中發現了NFE2L2基因中特定SNP與潰瘍性結腸炎發病風險之間的遺傳關聯（109）。NFE2L2啟動子中3個SNP功能單倍體NRF2表達略有降低，與胃黏膜炎癥和幽門螺桿菌感染相關消化性潰瘍的發生發展有關（60）。
肝臟是抵御食物、外來生物制劑和口服活性藥物的第一道防線，因為從消化道流出的大部分血液通過肝門靜脈直接流到肝臟。早期使用NFE2L2-/-小鼠證實了NRF2對對乙酰氨基酚的保肝作用（110），NRF2的遺傳活化也是如此（111）。正如可能預期的那樣，喂食酒精（4-7天）的NFE2L2-/-小鼠比同樣喂養的野生型小鼠明顯更容易脂肪肝加重、肝臟炎癥反應和肝功能衰竭，這在一定程度上可能是SREBP脂源性轉錄因子的激活和對乙醛解毒的相對無能（112）。通過觀察NRF2在小鼠肝部分切除后對肝臟再生的阻礙，發現NRF2調控NOTCH1基因表達（113），這一機制也參與了NRF2介導的造血干細胞祖細胞功能改善和電離輻射后骨髓抑制（114）。在遺傳性血色素沉著癥伴鐵超載的小鼠模型中(由于穩態鐵調節基因突變)，敲除NRF2增加了小鼠肝臟內導致肝纖維化的壞死炎癥病變（115）。與這些觀察結果一致，原發性膽管炎和肝硬化患者NRF2表達減少（116。）
代謝性疾病
代謝性疾病又稱代謝綜合征，以腹部肥胖、高血壓、高甘油三酯血癥、低水平高密度脂蛋白和空腹高血糖為特征。它與2型糖尿?。═2DM）和相關的合并癥如血管功能障礙、心血管疾病、腎小球腎炎、非酒精性脂肪性肝炎（NASH;見下文）和認知障礙密切相關。盡管T2DM及其合并癥的特征在于線粒體產生過量超氧化物（117），但NRF2缺失小鼠不會自發地發展成糖尿病。實際上，敲除小鼠表現出增加的胰島素敏感性，這歸因于ROS介導的蛋白酪氨酸激酶磷酸酶1B的抑制，該蛋白拮抗胰島素信號（118）。相比之下，db/db背景下小鼠中KEAP1敲除或敲低對NRF2的遺傳激活，或db/db小鼠中NRF2的藥理活化，抑制了T2DM的發生（119）。因此，似乎當胰腺β細胞代謝挑戰合成胰島素以應對高血糖時，所產生的ROS負擔可能會導致氧化損傷、損害反應、導致T2DM（120,121）。如果這個結論是正確的，那么很可能在飲食誘導的T2DM小鼠中，TBE-31或SFN激活NRF2后，胰腺功能的改善對葡萄糖處理的改善有顯著的作用（122,123）以及富含SFN西蘭花芽提取物對T2DM失調肥胖患者空腹血糖和糖化血紅蛋白(HbA1c)的降低作用（123）。除了增加對胰腺β細胞的抗氧化應激能力之外，NRF2活化可通過增加糖原分支酶和磷酸化酶b激酶α的表達來抑制骨骼肌中的糖原分解，從而有助于改善全身葡萄糖穩態（119）。在糖尿病腎病小鼠模型中，SFN或肉桂醛對NRF2的藥理激活已被證明可抑制氧化應激以及轉化生長因子β1信號傳導和纖維化（124）。
NRF2可能在胰島素抵抗中發揮關鍵作用，因為它在糖尿病患者的單核細胞中表達很低（125）。令人信服的證據來自遺傳關聯研究，表明導致低NRF2表達的一些NFE2L2多態性導致病理性ROS和T2DM的風險增加（126-128）。關于并發癥，由于KEAP1啟動子中CpG島的去甲基化導致的抗氧化保護失效與糖尿病白內障有關（129）。
NRF2也可能對NASH的發展具有保護作用。在使用缺乏蛋氨酸和膽堿飲食的NASH小鼠模型中，NRF2缺失小鼠比野生型小鼠死于該疾病的速度要快得多（130,131）。在更為生理的NASH模型中，喂食高脂肪飲食的NRF2缺失小鼠也會出現肝臟脂肪變性和炎癥惡化，這表明需要NRF2來抑制這些癥狀的發生（118, 132）。此外，野生型而非NRF2敲除小鼠，在長期高脂肪、高果糖飲食使其變得肥胖和胰島素抵抗后，通過三環氰基酮TBE-31對NRF2藥理激活后，逆轉了胰島素抵抗，抑制肝臟脂肪變性，改善NASH和肝纖維化（122）。TBE-31對NRF2的藥理激活拮抗SREBP1c和ChREBP及其脂質生物合成靶基因的表達，這可能涉及AMPK的激活（122, 133）。此外，在小鼠肝臟中，NRF2的基因激活可拮抗糖異生酶PEPCK和G6PC的表達，這可能也涉及AMPK（133）。在NASH患者的肝臟活檢標本中，發現病理性ROS水平升高、NRF2基因表達增加，提示其試圖減輕氧化和炎癥（134）。
心血管疾病
ROS的產生和處理之間的不平衡導致破壞性氧化物質的過度形成，已被認為在許多心血管疾病中發揮作用，如高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病血管疾病、心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭（135）。此外，血管壁內的低度持續性炎癥是動脈粥樣硬化易損斑塊的形成過程和發展特點，所以動脈粥樣硬化斑塊易破裂，進而導致血栓形成和終末器官缺血。鑒于NRF2是抗氧化防御的關鍵調控因子，且具有直接的抗炎特性，因此可以合理地假設NRF2可以預防與ROS相關的心血管疾病。事實上，包括富馬酸鹽和硫化氫在內的NRF2激活劑在許多心血管疾病動物模型中顯示出了保護作用，如心臟缺血再灌注損傷（136, 137）和心力衰竭（138, 139）。NRF2在高膽固醇血癥小鼠模型動脈粥樣硬化中的作用就不那么直接了：在骨髓來源細胞中NRF2的缺失加重了動脈粥樣硬化（140, 141），而根據病變發展程度評估的NRF2全面缺失減輕了動脈粥樣硬化（142-145），但增加了斑塊炎癥和易損性（145）。然而，一些NRF2激活劑已被證明在多種動脈粥樣硬化動物模型中具有動脈粥樣硬化保護作用（146-148）。由收縮性、細胞骨架蛋白和分子伴侶蛋白突變引起的心臟疾病約占遺傳性心肌疾病的30%（149）。在某些情況下，還原而不是氧化應激，再加上蛋白質聚集，與心肌病有關。血液透析患者全身炎癥和病理ROS的形成與NRF2的下調有關（150），位于NFE2L2啟動子的多態性與這些患者死亡率的增加有關（151）。NRF2信號通路的破壞可防止還原性應激并延緩過量表達心臟中CRYAB（α-結晶B鏈）小鼠蛋白質性心臟?。?52）。因此，正如這篇綜述所強調的，針對NRF2的環境非常重要——越多不一定越好。
神經退行性疾病
在各種形式的神經退行性疾病中，NRF2和蛋白穩定之間的聯系尤其密切，因為這些疾病的特點是蛋白異常聚集（43）。NRF2在蛋白質病中具有保護作用的令人信服的證據已經在阿爾茨海默?。ˋD）模型的淀粉樣病變（153,154）、tau病變（155）或兩者皆有（40, 156, 157）以及帕金森?。≒D）模型的α-突觸核蛋白病變（158-160）中得到證實。在人類，APP受損和tau損傷神經元NRF2及其靶蛋白p62 / SQSTM1表達增加（40,161）。這些發現與最近報道的NRF2上調巨自噬（40）和分子伴侶介導自噬（39）的基因表達作用是一致的，這是清除APP、tau和α-突觸核蛋白的兩種必要機制。NRF2上調保護神經元免受突變型α-突觸核蛋白和leucinerich重復激酶2（LRRK2）的毒性（162），LRRK2也導致與錯誤折疊蛋白質聚集相關的神經變性（163）。奇怪的是，盡管NRF2激活增加了α-突觸核蛋白的降解，但錯誤折疊的彌漫性LRRK2被隔離到包涵體中。
NRF2在星形膠質細胞和小膠質細胞中的作用尤其重要，因為它們在大腦中表達水平最高(圖2b)。通過使用帶有ARE驅動的堿性磷酸酶報告基因的轉基因小鼠，我們發現星形膠質細胞在幾種神經變性模型中對NRF2的激活反應高度敏感（164），這表明NRF2通過對即將死亡的神經元提供代謝和GSH前體而在星形膠質細胞的培育作用中具有相關性（46, 165）。小膠質細胞作為大腦的免疫應答細胞，在NRF2介導的應答中也起著至關重要的作用（166, 167）。在帕金森毒素甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶致小鼠PD模型中，NRF2可調節小膠質細胞動力學，從而降低COX2、NOS2、IL-6和TNF的生成，并增加多種抗炎標志物的水平（55, 168）。tau損傷神經元激活小膠質細胞似乎至少部分地通過與分形趨化因子相互作用有關。在小鼠和人類，tau損傷神經元釋放出分形趨化因子，抑制鄰近的小膠質細胞中GSK3并導致NRF2蛋白的增加。反過來，NRF2減少TNF和IL-6的釋放，并參與小膠質細胞的重編程，以達到愈合傷口（161）。
一些NRF2靶基因，包括HMOX1、NQO1、GCLM和SQSTM1，在AD和PD腦中上調（159,169-171）。通過對NFE2L2啟動子中3個SNP的功能單倍型與疾病風險之間關系的遺傳分析，證明了這種上調的相關性。在肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)中，一種保護性的單倍體等位基因與疾病發作延遲4年有關（172），但另一項研究沒有發現明顯的關聯（173）。在AD中，另一個單倍型變異與早2年發病有關（76）。已經報道了PD的更詳細證據。最初，保護性單倍型與瑞典隊列中疾病發作延遲相關，并且波蘭隊列PD患者的風險降低（77）。之后，這些研究結果在四個獨立的歐洲病例對照研究中得到了重復（174），但臺灣人口卻沒有（175），這表明存在種族和/或環境差異。NRF2的藥理激活也有望用于治療亨廷頓病(Huntington disease, HD)和弗里德雷希共濟失調(Friedreich ataxia, FRDA)，對于這兩種疾病來說，氧化應激和炎癥是重要的病理驅動因素。在小鼠、來自HD和FRDA患者的模型生物體和培養細胞中進行的研究報告了NRF2信號通路受損（53,176 - 178）以及藥理學NRF2激活劑的有益作用。因此，三唑衍生物對NRF2的激活抑制了HD原代小鼠小膠質細胞和星形膠質細胞以及來自HD患者的培養單核細胞促炎細胞因子的釋放（53），并且在離體HD大鼠皮質紋狀體腦切片和HD果蠅模型中具有神經保護作用（179）。在HD、DMF和三萜類化合物的小鼠模型中，CDDO-乙基酰胺和CDDO-三氟乙基酰胺改善了動物的腦病理和行為（180,181）。用SFN和環狀氰基酮TBE-31或RTA-408處理改善了FRDA小鼠模型成纖維細胞、小腦顆粒神經元以及FRDA患者成纖維細胞的線粒體功能和抗氧化能力（182,183）?？偠灾?，現有證據表明NRF2的適度激活對大腦具有神經保護作用。
NRF2-KEAP1信號通路和癌癥
據報道，NRF2具有抗腫瘤和促腫瘤作用。在這里，我們簡要總結了目前對NRF2在癌癥中作用的理解，并參考了最近在癌癥背景下討論NRF2的全面綜述（12）。
在非惡性細胞中，NRF2激活對氧化劑誘導的遺傳損傷以及化學和物理致癌物具有抵抗性，這是由于NRF2激活增強了機體的防御能力，包括抗氧化（184）、放射性保護（114）以及加速DNA損傷劑的生物轉化和清除（185）。此外，NRF2轉錄反應的激活似乎將ROS水平維持在低于對腫瘤發生關鍵蛋白質發送信號所必需的水平，例如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）、絲裂原活化激酶、缺氧誘導因子1和NF-κB（186）。
相反，在腫瘤發展的早期階段，選擇具有NRF2組成型激活的癌細胞作為能夠適應惡劣微環境、化療、放療或高內源ROS水平的方式。此外，在快速增殖的細胞中，NRF2通過增強核苷酸（26）和氨基酸（187）的生物合成來支持中間代謝，但也會產生代謝失衡和對谷氨酰胺酶的依賴，這可能用于治療（188,189）。
KEAP1的體細胞功能缺失突變或NFE2L2的功能獲得突變在非小細胞肺癌和其他一些環境因素是重要病因的癌癥中很常見（190）。癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中的NRF2突變綜合目錄在10364例中識別出226個獨特的NRF2突變腫瘤，其中33種腫瘤類型中有21種發生了功能獲得性NRF2突變（191）。這種突變的頻繁發生表明NRF2抑制劑在癌癥治療中的潛在益處，從而引發對此類藥物的研究(Box 1)。這些NRF2抑制劑代表了藥理學的一個完全開放的領域，目前處于概念驗證研究的水平。NRF2抑制的替代方法包括靶向依賴NRF2和/或在KEAP1突變癌細胞中選擇性表達的蛋白。例如谷氨酰胺酶（188, 189）和NR0B1的抑制劑，NR0B1是一種非典型的孤兒核受體，在多聚體蛋白復合物中調節KEAP1突變細胞的轉錄（192）。然而，值得注意的是，目前尚無證據表明單單KEAP1或NFE2L2突變能夠引發惡性轉化，與致癌驅動因子共發生似乎是必要的，PI3K通路改變與惡性轉化的相關性最強（193）。
最能說明問題的是，KEAP1亞等位基因敲低的NRF2全基因組上調小鼠不會自發形成腫瘤（194, 195），而小鼠肺中同時缺失Keap1和PTEN則會促進腺癌的形成（195）。重要的是，由此產生的腫瘤具有免疫抑制微環境的特征，可通過免疫檢查點抑制劑進行治療（195）。很明顯，NRF2基因激活是腫瘤發生的重要因素，因為癌基因(KRASG12D)激活嚙齒動物NRF2信號可以增加腫瘤發展（196）,而KEAP1基因敲低(也導致NRF2信號激活)強烈阻礙NOTCH1驅動的腫瘤發生（197）以及紫外線輻射介導的皮膚癌發生（51, 198）。值得注意的是，在后一種模型中，同時喪失NRF2可以消除KEAP1敲低對皮膚癌發生的保護作用（199）。 NRF2的這種兩面作用得到廣泛的實驗證據支持，在這些實驗證據中，NRF2的激活增強了抗腫瘤免疫，以防止肺癌的發生，但只有在腫瘤發生后才會加速惡性生長（200）。此外，與野生型同窩小鼠相比，接受化學誘導致癌作用的NFE2L2敲除小鼠表現出腫瘤數量增加（啟動增強）但體積小得多（進展受損）（201）。因此，低NRF2活性促進癌發生的起始，而持久的組成型高NRF2活性可以驅動癌癥進展和對治療的抗性（202）。
NRF2調節劑的臨床開發
富馬酸酯。富馬酸酯代表一組NRF2激活劑，工業上對此進行了大量的研究。臨床最成功的例子是DMF（化合物1，圖3a），它于1994年被批準用于治療銀屑病，并且基于其在MS的EAE小鼠模型中的功效（203），于2014年被Biogen（Tecfidera）重新用于治療復發-緩解型MS。在發現NRF2之前，對嚙齒動物的早期研究報道DMF是NRF2轉錄靶點GST和NQO1的強效誘導劑（204），后來發現DMF代謝物富馬酸單甲酯(MMF;化合物2，圖3a)與KEAP1中的C151反應，激活NRF2（203）。自從發現DMF的誘導劑活性以來，安全性一直是一個優先考慮的問題，并注意到獲得顯著酶誘導劑所需DMF濃度對嚙齒動物具有良好的耐受性（204）。DMF在兩個III期試驗中表現出良好的安全性和耐受性（205, 206），自其商業化以來，它已成為近年來最成功的新藥之一。然而，Tecfidera的一個缺點是出現輕度至中度腹痛、潮紅、腹瀉和惡心。盡管可以控制這些不良反應，但是更嚴重的癥狀是在治療開始時白細胞計數低的患者發生白細胞減少癥。事實上，用DMF治療的動物神經系統中粒細胞的水平遠低于未接受該藥物治療的動物（207）。該作用與NRF2無關，但很可能是由于羥基羧酸受體的活化，因為缺乏該蛋白質的小鼠具有高水平的粒細胞，無論它們是否用DMF處理（207）。這些觀察結果強調了仔細選擇治療納入標準的重要性。
如上所述，DMF在體內代謝為MMF，通過在C151處形成加合物使KEAP1失活（203）。由于這種代謝轉化，一些生物制藥公司正在開發具有緩慢和持續釋放MMF的化合物，與DMF相比，其顯示出改善的生物利用度和更少的副作用（表1）。Alkermes（被Biogen收購）開發了富馬酸迪羅西酯（BIIB098，以前為ALK8700，化合物3;圖3a），一種具有降低GI副作用的MMF前藥，現在正在進行MS的III期臨床試驗（NCT03093324）。 XenoPort（由Arbor Pharmaceuticals收購）開發了富馬酸富馬酰胺，一種MMF前藥（XP23829，化合物4，圖3a）。與DMF相比，XP23829在臨床前模型中具有更高的溶解度和滲透性，口服給藥后更大的吸收，改善功效和降低GI副作用，并且現在處于斑塊狀銀屑病的II期臨床試驗中（NCT02173301）。Catabasis制藥公司正在開發另一種MMF和二十二碳六烯酸(CAT4001)的化學連接偶聯物，與單獨的生物活性分子相比，這種偶聯物具有增強細胞靶向性、有效性、安全性和耐受性的潛力。特定的酶釋放細胞內的兩個組件，同時調整多個生物目標，包括細胞和動物模型中的NRF2和NF-κB, 并顯示出治療神經退行性疾?。ㄈ鏔RDA和ALS）的前景。V ClinBio正在開發一種類似的技術，用于治療MS和銀屑病的MMF和二十碳五烯酸（VCB101，化合物5，圖3a和VCB102）的結合物（表1）。
蘿卜硫素（SFN）。SFN一種廣泛應用的天然親電NRF2激活劑 (化合物6，圖3a)。該化合物最初由Paul Talalay和Yuesheng Zhang作為十字花科植物提取物NRF2靶酶NQO1的主要誘導物分離得到的（208），并與KEAP1的C151相互作用(14，209)。值得注意的是，SFN可通過血腦屏障（55），并在許多神經系統疾病的臨床前模型中具有保護作用（210）。在一項針對患有自閉癥譜系障礙年輕男性的雙盲安慰劑對照臨床試驗中，口服富含SFN的西蘭花芽提取物膠囊，通過異常行為檢查表和社會反應量表評估，在行為方面改善顯著；這些量表上的總分數在停止治療后逆轉至治療前水平（211）。三日齡的西蘭花芽富含葡萄糖苷，一種SFN前體分子，可被植物黑芥子酶水解，釋放出SFN和葡萄糖（212）。類似的β-硫葡糖苷酶存在于腸道微生物群中；因此，釋放的SFN實際水平高度依賴于飲食習慣和微生物組成，受抗生素治療的影響（213）并表現出晝夜節律（214）。并且，無論是芽苗提取物還是高度純化的SFN，已有超過500名受試者接受超過25,000劑量，證明了具有高度安全性。目前有超過20個正在進行的臨床試驗。
考慮到天然化合物知識產權的相關問題、SFN在室溫下不穩定以及需要精確控制劑量，Evgen Pharma開發了SFN的藥物形式，SFX-01（化合物7，圖3a） 。 SFX-01是化學合成的SFN，包裹在環糊精中，形成穩定的固體形式的丸劑或膠囊，具有良好的生物利用度。SFX-01目前正在用于蛛網膜下腔出血(NCT02614742)和轉移性乳腺癌(NCT02970682)臨床試驗(表1)。Evgen還有一系列基于SFN的新型類似物，這些類似物正處于臨床前評估階段。此外，許多營養保健品公司正在生產含有NRF2誘導劑的制劑，包括SFN，具有不同程度的標準化。其中一個例子是來自Nutrinov實驗室的Prostaphane，它是一種穩定的游離SFN，從花椰菜種子中提取，在前列腺癌的安慰劑對照臨床試驗中顯示了在根治性前列腺切除術后控制生化復發的優勢（215）。SFX-01和Prostaphane的生物利用度和效力等同于穩定性較差的SFN（216）。另一個例子是膠囊膳食補充劑Avmacol（Nutramax Laboratories），含有來自精細研磨的花椰菜種子的蘿卜硫苷和冷凍干燥的西蘭花芽粉末以提供黑芥子酶。該補充劑目前正在臨床試驗中用于調節與自閉癥譜系障礙、精神分裂癥和環境污染有關的疾病癥狀和/或生物標志物（217）。
氰基酮三萜。越來越多的證據表明，富馬酸酯、SFN以及與KEAP1共價結合的其他小親電試劑可以從更大的支架結構中受益，以賦予更好的選擇性（和可能的效力）和更可控的藥代動力學和/或藥效學特性。含五環邁克爾受體的氰基酮三萜類化合物的開發可滿足這些要求。這些五環三萜類化合物最初由Michael Sporn、Gordon Gribble和Tadashi Honda開發，來自天然產物齊墩果酸（218, 219），這些五環三萜類化合物是迄今已知最有效的親電子NRF2激活劑（220），由KEAP1中的C151檢測，目前正在由Reata Pharmaceuticals和Kyowa Hakko Kirin進行臨床開發。
兩種臨床上先進的化合物，bardoxolone methyl（BARD;化合物8，圖3a）和omaveloxolone（化合物9），能使代謝正?；?、增加線粒體能量產生、增強細胞抗氧化能力和降低ROS水平（221）（表1）。在臨床前研究中，BARD或類似物已被證明可通過減少炎癥、纖維化和氧化應激以及增加腎小球的過濾表面積來改善腎功能（222, 223）。通過修改選擇標準以排除有早期心力衰竭跡象的患者（B型利鈉肽升高），BARD目前正在臨床試驗中測試幾種與慢性腎?。–KD）相關的罕見病癥，大多數沒有經批準的治療方法，包括Alport綜合征（NCT03019185）、常染色體顯性遺傳性多囊腎病、免疫球蛋白A（IgA）腎病、1型糖尿病和局灶性節段性腎小球硬化（NCT03366337），其中促炎和促纖維化過程造成腎小球硬化和腎功能受損（224）。BARD治療有可能延緩或預防腎小球濾過率下降，而腎小球濾過率下降會導致Alport綜合征和其他罕見形式CKD患者需要透析或移植。因此，在患有T2DM和CKD患者的II期臨床試驗中（NCT02316821），BARD治療可使直接測量腎小球濾過率的統計學顯著增加，并且在排除具有液體潴留風險患者后，耐受性良好。在這些結果的基礎上，Kyowa Hakko Kirin在患有G3期或G4期CKD的糖尿病患者中，在日本SAKIGAKE指定系統的支持下，開展了III期臨床試驗（NCT03550443）。
此外，BARD正在用于研究肺動脈高壓（PAH）（NCT03068130）和結締組織?。–TD-PAH）引起的PAH（NCT02657356），這是一種導致心力衰竭和死亡的嚴重和進行性疾病。CTD-PAH與特發性病因之間的差異很大程度上歸因于炎癥、自身免疫和系統性血管病變之間復雜的相互作用，這些相互作用促成了結締組織疾病的發病機制。由于NF-κB的上調，CTD-PAH患者的炎癥加重（225），對現有血管擴張劑治療的反應性低于特發性PAH患者，預后較差（226）。在II期研究中，對CTD-PAH患者進行了BARD測試，目前正在III期研究中進行測試。Omaveloxolone目前正在FRDA患者（NCT02255435）的II期臨床試驗中進行測試，這是一種遺傳性神經肌肉疾病，其NRF2被下調（176-178）。值得注意的是，目前尚無批準治療FRDA的療法（227）（表1）。
硝基脂肪酸。脂肪酸的硝化衍生物(NO2-FAs)是內源性信號介質，在代謝和炎癥疾病的臨床前動物模型中具有抗炎和抗纖維化活性（228）。硝基烯烴基團賦予其β-碳親電性，促進與親核試劑如半胱氨酸的可逆NO2-FA邁克爾加合物的快速形成，這種改性稱為硝基烷基化（22, 230）。已經表明，硝基油酸（NO2-OA; 9-硝基十八碳-9-烯酸）與KEAP1中的半胱氨酸反應，包括C273和C288，從而激活NRF2（231,232）。該反應的可逆性阻止了穩定的NO2-FA硫醇加合物積累的可能性，這可能導致細胞毒性（219,230,233）。實際上，I期安全性評估證明了先導化合物CXA10（10-NO2-OA; 10-硝基-十八碳-9-烯酸，NO2-OA的特異性區域異構體）（化合物10，圖3a）在藥理活性劑量下對人體是安全的（234）。目前，Complexa正在開發CXA10作為局灶性節段性腎小球硬化和PAH的治療方法（234）（表1）。最近報道了來自α-生育酚的硝基烯烴合成和生物學評價（235）。
羥胺。一個特殊的挑戰是提供可以通過血腦屏障的NRF2激活劑。給藥途徑（注射、口服或局部）對特定疾病也至關重要。Othera Pharmaceuticals（現由Colby Pharmaceutical收購）正在開發一種具有抗氧化特性的二取代羥胺（OT551），局部應用，通過靶向KEAP1抑制氧化應激和疾病相關炎癥（化合物11，圖3a）。在臨床前研究中，該化合物的眼用溶液保護視網膜色素上皮細胞和光感受器免受氧化損傷和炎癥反應，并且一項關于年齡相關性黃斑變性的II期試驗已證明可有效預防視力喪失的進展（NCT00485394）（表1）。
TFM735。一種高通量篩選報告子策略評估了包含融合到LacZ (NRF2d-LacZ)236的NRF2氨基末端區域嵌合蛋白的穩定性，該策略確定TFM735為先導化合物（化合物12，圖3a）。TFM735以C151依賴性方式激活NRF2，并抑制受刺激的人外周血單核細胞中IL-6和IL-17合成以及小鼠EAE進展（237）。該化合物目前由Mochida Pharmaceuticals進行治療MS的臨床前開發（表1）。
NRF2-KEAP1蛋白-蛋白相互作用抑制劑。近年來，非親電性非共價化合物的發展受到關注，這些化合物可以直接干擾KEAP1和NRF2之間的PPI(238)，或者干擾KEAP1和CUL3之間的PPI(239)。通過直接干擾KEAP1和NRF2或CUL3之間的相互作用，化合物的作用方式不需要共價結合組分。該方法具有潛在的優點，包括探索NRF2誘導物的新化學型的范圍，由于與KEAP1的不同相互作用模式導致的不同藥效學以及由于半胱氨酸非依賴性結合機制導致的不同脫靶效應譜。有證據表明，親電子和非親電子（PPI）KEAP1抑制劑的生物學效應譜不同，一個例子是非親電試劑誘導線粒體自噬的能力，與SFN和DMF等親電試劑相比；這表明兩種化合物類別之間藥理活性和治療效用的潛在差異。
PPI抑制劑的設計是以KEAP1的Kelch結構域的晶體結構可用性為指導的(241-243)(圖3b)。已經報道了幾種類型的PPI抑制劑；根據制藥行業投入開發的主要化學類別如圖3b所示。萘雙磺酰胺化合物起源于Biogen的高通量篩選（244），隨后由中國藥科大學Jiang等人提供化合物13（CPUY192018）和類似物（245）。該雙羧酸化合物是KEAP1的高親和力配體，在低微摩爾濃度下誘導ARE依賴性基因的表達。Astex和葛蘭素史克還從基于X射線晶體學碎片的篩選程序中鑒定了含磺酰胺的鉛化合物。在這種情況下先導化合物的例子是化合物14，KEAP1-NRF2 PPI低納摩爾抑制劑，它能增加COPD患者上皮細胞中NRF2靶基因NQO1的表達。該化合物能夠在靜脈內給藥后減輕大鼠的肺部炎癥，并有效抑制臭氧誘導的支氣管肺泡液中白細胞的積累并恢復GSH濃度（246）。來自該系列的化合物已經在幾種模擬肺病特征的氧化應激動物模型中顯示出功效，并且目前正在開發用于臨床評估。已經開發了另外兩類不是磺酰胺的單酸性PPI抑制劑。第一類是由胡等人在Rutgers開發（247），由Evotec和UCB Pharma詳細描述（248），包括四氫異喹啉(例如化合物15)，它們是KEAP1-NRF2 PPI的低微摩爾抑制劑。第二類是由Toray Industries和RIKEN開發的，并加入了惡二唑基序；化合物16是PPI抑制劑，具有微摩爾范圍內的結合活性（249）。突出顯示的化合物或其類似物已與KEAP1 Kelch域共結晶；圖3b顯示了化合物13-16所獲得的結合位點亞袋的占用情況，并為這些配體未來的精煉提供了思路。
C4X Discovery利用計算化學、配體核磁共振光譜和蛋白質結晶學方法以及Keapstone利用基于結構的藥物設計方法聯合開發了新的PPI抑制劑。學術團體也在為非親電NRF2誘導物研究做出貢獻（250,251）。
如何使PPI抑制劑具有適當的藥物代謝和藥代動力學特性，用于外周神經系統和中樞神經系統，仍然是一個重大挑戰，后者是一個需要具有強安全性NRF2激活劑用于長期給藥等條件的領域，如AD和PD。此時，非親電性PPI抑制劑改善靶向選擇性的潛在優勢被當前化合物相對較高的分子質量、阻斷較大KEAP1-NRF2界面的要求以及極性官能團賦予KEAP1緊密結合親和力的需要所抵消。因此，目前通過體外研究鑒定的許多原型化合物表現出較差的吸收、分布、代謝和排泄性質。例如，萘雙磺酰胺（化合物13）對DSS誘導的小鼠結腸炎具有保護作用，在低微摩爾范圍內激活NCM460培養細胞中NQO1表達，并在體外與納米級Kd結合，說明蛋白質結合與生物活性之間的相互抵消（252）。
大多數PPI抑制劑的體內評價都集中在外周炎癥。例如，化合物NK-252（化合物16的類似物）被Toray Industries鑒定為相當弱的KEAP1抑制劑，但對H2O2誘導的細胞毒性具有保護作用并且降低了膽堿缺乏的l-氨基甲酸鹽飲食大鼠（NASH模型系統）的纖維化評分（253）。
用KEAP1非依賴性藥物靶向NRF2。越來越多的證據表明，NRF2除了KEAP1所發揮的作用外還表現出多層調節，如轉錄（196）、表觀遺傳（254,255）、共價蛋白修飾（258,257），以KEAP1非依賴性方式進行蛋白酶體降解（258-261）以及NRF2二聚體伴侶的靶向結合ARE序列的調節（262,263）。在藥理學發展水平上，ARE介導的基因調控的KEAP1非依賴性機制涉及調節轉錄抑制因子BACH1（廣泛復合物，tramtrack、bricàbrac和cap'n'collar同源體1），該機制抑制NRF2調控基因亞基的失活，尤其是HMOX1（28）。vTv 療法現在正在分析該亞基是否足以引起治療用處。他們開發了一類新的非親電子小分子，可以獨立于KEAP1抑制BACH1與某些ARE驅動基因的結合（264）。
挑戰與思考
藥效學評價。考慮到NRF2的半衰期很短，即使在藥物誘導穩定后，也需要通過間接指標來推斷其在病變器官中的激活情況，從而確定最合適的治療方案。一種可能性是分析可接觸的細胞或組織（如外周血單核細胞、鼻腔灌洗液細胞、脫落的膀胱細胞、頰細胞和皮膚）中的藥物分布和NRF2基因表達特征，希望NRF2的轉錄組特征反映了其他組織（如肺，肝和腦）的局部參與（265-267）。群體不可避免地暴露于有害環境化學物質的情況下，尿液中相應代謝物的水平已被用作NRF2介導的藥效學作用生物標志物（268,269）。
NRF2通路的激活表現為依賴于時間、組織、劑量、發病時間和持續時間的差異基因表達。表2顯示了NRF2調控基因產物代表性亞群的半衰期。由于其中許多蛋白質的半衰期相當長，其生物化學活性的持續時間預計將遠遠長于NRF2穩定的時間間隔或其藥理激活劑的存在，后者通常在數小時內被清除。因此，NRF2活化分子的藥效學觀察時間比NRF2水平要長得多，且與血漿藥物濃度不一致。因此，NRF2激活劑TBE-31（一種與上述三萜類化合物密切相關的三環氰基酮）在小鼠皮膚和血漿中的半衰期為10小時（51,270），而NRF2依賴的NQO 1誘導蛋白在最后一劑局部應用藥物3天后仍可在皮膚中檢測到（51）。因為NRF2激活劑導致“刺激產生或抑制控制測量效果的因素”，所以“間接藥效學反應”模型可能是用于測試NRF2激活劑藥效學走向臨床應用的更合理方法（272,272）。
NRF2活化藥物在相關組織中的濃度和分布，以及它們的溶解度、細胞通透性、代謝穩定性和蛋白結合，也將在NRF2活化程度中發揮重要作用，最終達到預期的長效藥效學效果。因此，優化臨床有意義的藥物暴露需要通過一個假定的NRF2激活劑分析劑量依賴性基因調控。此外，NRF2靶向參與研究必須考慮患者的年齡和表現狀態，因為在年齡較大和健康狀況較差的受試者中，藥物激活NRF2或促進“適應性反應”的能力似乎有所下降。最近在DMF復發緩解型和多發性硬化癥患者的臨床試驗中發現，NRF2轉錄靶NQO1的誘導程度與患者年齡呈負相關, 在4 - 6周高NQO1蛋白含量的患者在開始治療后的第二年更有可能沒有疾病活動的證據（267）。
藥物選擇性。KEAP1中高活性半胱氨酸的鑒定對于理解親電化合物與泛素連接酶底物適配器共價作用的機制至關重要。結構信息表明，某些作用于C151的藥物可能會干擾與CUL3-RBX1的相互作用(273, 274)，從而使KEAP1庫被結合的NRF2飽和，并允許新合成的NRF2逃避降解: 這是用親電試劑n -碘乙酰- n -生物素己二胺模型證明的（275）。其他化合物可能會修飾KEAP1，使其不再能夠在轉錄因子內的高親和力和低親和力位點與NRF2相互作用。值得注意的是，一些親電的NRF2激活劑，如環氰烯酮，以共價形式與硫醇結合，但不形成不可逆的加合物（276,277）。因此，它們結合了不可逆共價藥物(即高效力和持續的靶點參與)和可逆非共價藥物(即缺乏永久性修飾，因此可能破壞或免疫原性其蛋白靶點)的理想特性（278）。這類分子的一個潛在缺點是，它們可能與KEAP1以外的蛋白質中對氧化還原敏感的半胱氨酸發生反應，從而影響其功能。巰基反應性分子的特異性問題表明，對于每種化合物，需要確定在其他蛋白質中不存在硫醇修飾的情況下允許治療相關KEAP1修飾的窗口（圖1b）。KEAP1內的靶半胱氨酸以及其他含巰基的非靶蛋白的這種分層呈現被稱為“半胱氨酸代碼”（279），并且受誘導劑的化學和劑量影響（280）。
KEAP1-NRF2 PPI抑制劑的一個重要潛在優勢是提高了靶點的選擇性。然而，對于任何小分子，不能完全排除脫靶效應。此外，KEAP1靶向NRF2以外的蛋白進行泛素化，這些蛋白也可能受到影響（281）。PPI抑制劑的脫靶選擇性已被評估的幾種類型之一是強效單酸性磺胺類；例如，化合物14似乎對KEAP1具有相當的選擇性，在葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline)增強的體外實驗交叉屏幕面板中顯示出適度的活性，以識別潛在的脫靶效應（246）。
動物模型。阻礙大多數慢性病藥物開發成功的一個問題是動物模型中人類病理的不完全可復制性（288）。這一問題可能與人類退行性疾病缺乏一個非常重要的標志有關，即與NRF2相關的體內平衡功能的逐漸喪失。事實上，盡管在人類仍有許多工作需要做，但動物研究證據表明，NRF2活性隨著年齡的增長而下降，并且NRF2的藥理學或遺傳學上調可延長壽命并改善健康狀況（283, 284）。慢性疾病動物模型缺乏“NRF2變量”，這在AD小鼠模型中得到了很好的證明。目前的模型是基于這樣的假設，即有毒的APP或tau突變蛋白在原本健康的動物背景下的表達復制了人類的病理。盡管這些模型提供了關于蛋白病的發病和進展的有價值信息，但是它們未能將治療成功應用于人類。這種失敗的原因可能與這些模型不考慮與NRF2相關穩態功能的疾病相關性下降這一事實有關。更復雜的臨床前模型將需要一種反向翻譯方法，這種方法不僅要在動物身上復制特定疾病的解剖病理特征，而且要復制受損的氧化還原、炎癥或蛋白穩態。因此，NRF2敲除小鼠與AD患者甚至老年人有許多共同改變（156）。最近的研究表明，與野生型動物相比，喂食高脂肪食物的NRF2敲除小鼠表現出更大的神經血管功能障礙、血腦屏障破壞、神經炎癥、淀粉樣基因表達和認知能力下降，這與隨著年齡增長而發生的許多表型變化類似（285）。引入低NRF2表達作為降低穩態反應的變量，可能有助于改進現有的慢性病模型，以獲得更好的治療效果?？紤]到隨著衰老NRF2活性的緩慢下降，雜合的NFE2L2 +/-小鼠可能是復制基礎表達減少和藥理學上調的合適模型。
癌癥風險。從藥理學角度來看，有必要確定NRF2水平升高超過致癌安全閾值的風險有多大(圖4)。促進NRF2在癌細胞中穩定性的體細胞突變影響與NRF2的藥理學激活引起的影響存在顯著差異。因此，KEAP1和NFE2L2的體細胞突變導致NRF2活性升高而不受限制，這與NRF2激活劑的藥理作用引起的脈沖激活完全不同。動力學特征，如曲線下的振幅和面積，反映NRF2信號的強度和持續時間，在基因激活設置和藥理學手段方面有很大差異（202, 286）。此外，KEAP1基因丟失或失活突變似乎與該蛋白的藥理學抑制作用不一樣。因此，KEAP1丟失導致的NRF2活性以及E3連接酶適配器的幾個致癌靶標（包括IKKβ和B細胞淋巴瘤2，bcl-2）增加，可能至少是惡性轉化的部分原因。因此，在具有功能性KEAP1的一組細胞系中，成熟的NRF2激活劑，即BARD類似物RTA-405，增加NRF2但不增加IKKβ或BCL-2水平，并且不賦予腫瘤細胞生長或存活優勢（287）。
雖然目前NRF2激活劑的癌癥風險不能被忽視，但令人鼓舞的是，DMF III期試驗薈萃分析顯示安慰劑和DMF治療組之間的癌癥發生率沒有差異（288）。 同樣重要的是要注意，一些NRF2激活藥物如果具有抗腫瘤作用的其他靶標可以降低這種風險。因此，最近發現DMF抑制GAPDH（289），并且這種抑制可能導致高度糖酵解的KRAS或BRAF突變癌細胞的能量危象，從而阻止腫瘤發展，如維生素C（290）。
展望
許多慢性疾病的標志是喪失穩態，如氧化還原信號、代謝靈活性、炎癥控制和蛋白質穩態。這些復雜疾病的多因素性質可以通過對轉錄因子NRF2的單次靶向激活，產生有益的、全面的、多靶點和持久的細胞保護作用。盡管KEAP1-NRF2系統的特殊性使得這種方法在監測靶向參與和脫靶效應方面特別具有挑戰性，但生物制藥公司正在緩慢而穩定地開發針對NRF2主要調控因子KEAP1的藥物。此外，需要明確排除增加癌癥風險的擔憂。在未來幾年，正在進行的臨床試驗無疑將在回答這些問題方面取得重要進展。
圖1：KEAP1對NRF2的調控及其藥理靶標。
圖2：KEAP1和NFE2L2 mRNA在人腦和血液中的表達。
圖3：KEAP1結構域的晶體結構。
圖4：根據NRF2的狀態調節癌癥風險。
摘要：轉錄因子NF-E2 p45相關因子2（NRF2;由NFE2L2編碼）及其主要負調節因子，E3連接酶受體Kelch樣ECH相關蛋白1（KEAP1）是維持氧化還原、代謝和蛋白質穩態以及炎癥調節的關鍵。因此，激活NRF2可對多種疾病起到細胞保護作用，包括肺和肝的慢性疾病、自身免疫病、神經退行性疾病和代謝性疾病以及癌癥啟動。一種NRF2激活劑已獲得臨床批準，并且基于半胱氨酸傳感器KEAP1的幾種親電修飾劑及其與NRF2相互作用的抑制劑目前正在臨床開發中。然而，在靶向特異性、藥效學特性、療效和安全性方面仍存在挑戰。
前言
轉錄因子NF-E2 p45相關因子2（NRF2;由NFE2L2編碼）于1994年作為人類cap 'n' collar（CNC）堿性區域亮氨酸拉鏈轉錄因子家族成員被發現（1）。隨后的研究，包括NRF2敲除小鼠的產生，確定NRF2調控約250個基因的表達，調控的基因在其啟動子調節區中含有增強子序列，稱為抗氧化應答元件（ARE）（2, 3）。這些基因編碼一個合作酶網絡，參與內生和外生生物轉化反應、抗氧化代謝、碳水化合物和脂類的中間代謝、鐵的分解代謝、蛋白質降解和炎癥調節（4）。通過這個轉錄網絡，NRF2能夠協調多方面應對各種形式的應激，維持穩定的內部環境。
1999年，Kelch樣ECH相關蛋白1（KEAP1）被鑒定為NRF2的抑制因子（5），又過了5年才被報道為E3泛素連接酶底物適配器，靶向NRF2進行蛋白酶體的快速降解（6-8）。因此，KEAP1確保在無應激條件下，NRF2是低豐度的蛋白質，具有僅約15-40分鐘的有限半衰期，這取決于細胞類型。然而，重要的是，KEAP1含有幾個高活性的半胱氨酸，經親電子分子修飾后，可防止其靶向NRF2進行蛋白酶體降解，從而導致NRF2蛋白在氧化還原應激下快速核聚集，并在與小肌肉筋膜纖維肉瘤癌基因同源蛋白（sMAF）二聚化后，通過NRF2-sMAF誘導含有ARE的基因（9,10）。
現在人們普遍認識到，由于NRF2-靶基因編碼的蛋白質的多功能和全面的細胞保護作用（包括抗氧化、解毒和抗炎），因此，NRF2-KEAP1信號通路對于預防以氧化應激和炎癥為基礎病理特征的多種疾病至關重要。這些疾病包括代謝、炎癥和自身免疫性疾病，肺、肝、腎、胃腸道和心血管系統疾病以及神經疾?。?, 11）。NRF2在這些非腫瘤性疾病中的保護作用的實驗證據將在本綜述的后面討論。我們還討論了NRF2在癌癥中的作用，這是一個需要深入研究的問題（12）。
通過單粒子電子顯微鏡獲得的KEAP1二聚體3D重建顯示，該蛋白具有叉狀莖結構，包括兩個大球體，它們包圍了中間區域（IVR）、Kelch和羧基末端結構域，而二聚化由BTB域介導（圖1a）（13）?？紤]到KEAP1包含許多不同且自主運作的半胱氨酸傳感器（C151、C226、C273、C288和C613）（14-16），現有證據表明，NRF2和KEAP1整合了一氧化氮、Zn2+、烯醛信號傳導與氧化還原信號傳導一起提供了一種可能至少部分進化的機制，以允許快速適應飲食中遇到的植物化學物質。許多植物來源的親電異種生物激活NRF2-KEAP1信號通路以引發細胞保護反應，KEAP1中的高活性半胱氨酸起直接傳感器的作用（17-19）。這些傳感器與親電子試劑的高反應性使得KEAP1在沒有非特異性硫醇修飾的情況下進行靶向治療成為可能（圖1b）。因此，已經描述了許多天然存在的NRF2靶基因誘導劑（20），并且新的誘導劑在不斷被發現。
盡管大量學術實驗室參與了NRF2激活劑的鑒定，但從歷史上看，制藥公司在這個令人興奮和充滿希望領域的參與度卻相當低。業界之所以不愿將NRF2-keap1信號通路視為有價值的藥物靶點，部分原因可能是其廣泛的生物化學活性，而不僅僅是控制由NRF2直接或間接調控的抗氧化系統。NRF2激活劑的各種直接和間接效應有時被解釋為非特異性效應的證據。然而，KEAP1中幾種不同的基于硫醇的氧化還原開關的進化允許哺乳動物適應廣泛的植物化學物質，這為改變NRF2的激活引起某些“脫靶”效應并采用更廣泛視野的觀念提供了理論基礎。NRF2的激活產生有益的“多靶點”細胞保護作用（11）。尤其是NRF2激活的多靶點效應包括維持氧化還原信號、增強異種生物轉化、控制和解決炎癥、抑制糖異生和肝脂肪生成、支持蛋白穩定和抑制纖維化（9）。在這方面，值得注意的是，大多數慢性疾病，特別是老年人的慢性病，沒有獨特的病因學，也沒有單一的病理表型，因此，它們可能通過激活NRF2的藥物得到最有效的治療。事實上，與更有針對性的治療干預相比，NRF2激活后廣泛的細胞保護機制的刺激不太可能被致病過程有效地淹沒或規避。
這種對NRF2作為潛在藥物靶標的廣泛認可引起了制藥業的興趣，并導致對NRF2調節劑臨床開發的大量投資（21）。NRF2激活劑富馬酸二甲酯(DMF;目前，商標名如Fumaderm或Tecfidera)已被臨床用于治療銀屑病和復發性多發性硬化癥(MS)(表1)，其目前的分布情況仍是其他制藥公司希望達到的目標。目前，多種不同化學類型的NRF2激活劑處于臨床開發的不同階段，如靶向KEAP1半胱氨酸的富馬酸衍生物、異硫氰酸硫蘿卜硫素(SFN;4‐異硫氰酸甲酰丁酯)、氰烯酮三萜、硝基脂肪酸和羥胺。其他候選藥物包括破壞NRF2-KEAP1蛋白-蛋白相互作用(PPIs)的非親電化合物，以及具有keap1獨立作用模式的分子。NRF2的抑制劑也在研究中，但尚未進行臨床試驗。本綜述概述了這些候選藥物，并強調了針對NRF2-KEAP1信號通路不尋常的性質和至關重要的意義。本文描述了NRF2在細胞氧化還原、代謝和蛋白穩態以及炎癥調控中的生理作用，并為NRF2在非腫瘤性疾病中的保護作用提供了實驗證據。評價了目前臨床開發的各種小分子NRF2活性藥理調節劑的優缺點。最后，強調了與NRF2調節劑開發相關的持續挑戰，包括靶點特異性、藥效學評估、生物利用度、有效性和安全性。
NRF2-KEAP1信號通路的生理作用
氧化還原、代謝和蛋白質穩態
自從其最初被發現參與生物轉化反應，調節某些細胞色素P450氧化還原酶、結合酶和ABC轉運蛋白的表達（表2），NRF2參與控制細胞內氧化還原環境的作用變得越來越明顯，最終將NRF2-KEAP1信號通路識別為“硫醇驅動的總開關”用于“整個系統范圍的氧化應激反應”（22）。NRF2調控參與NADPH生成的4個基因(葡萄糖6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、蘋果酸酶1和異檸檬酸脫氫酶1)的表達（23–26）。這種還原當量的供應進一步被大量氧化還原反應所利用，其中許多氧化還原反應也受到NRF2的調節。因此，NRF2調控氧化還原緩沖物還原型谷胱甘肽(GSH;其氧化形式為GSSG)，如谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶和數個谷胱甘肽s -轉移酶的催化和調節亞基（4）。此外，氧化還原蛋白家族中的許多輔助蛋白，如硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、過氧化物還蛋白和硫還蛋白，都受到NRF2的調控，提供區域活性氧生成的區域化傳感和信號轉導（ROS;即過氧化氫（H2O2）羥基和超氧自由基 ）（27-29）。除了這些對氧化還原狀態的直接影響外，NRF2還調節編碼酶的基因，這些酶可阻止醌參與氧化還原循環反應和谷胱甘肽耗竭（通過NAD(P)H:醌氧化還原酶1（NQO1））或參與間接生產膽紅素（血紅素加氧酶1（HMOX1）和膽綠素還原酶（BVR）），是最有效的非極性生理抗氧化劑（30）。最后，NRF2通過與戊糖磷酸途徑和糖酵解的相互作用，影響中間代謝，增加底物的可用性，減少線粒體呼吸鏈的等效物（31），并維持線粒體DNA （mtDNA）的完整性（32）。
NRF2在氧化還原改變或營養缺乏期間參與清除氧化或其他損傷的蛋白質和細胞器。因此，自噬轉運蛋白泛素結合蛋白p62(由SQSTM1編碼)是NRF2的轉錄靶點，它通過其泛素關聯域(UBA)與泛素化產物相互作用，并通過其LC3相互作用的基序將其招募到自噬體中（33, 34）。此外，KEAP1與p62結合（33, 35），最近的一項研究發現KEAP1-CULLIN 3（CUL3）在其UBA結構域中的K420位點泛素化p62，從而促進p62的螯合活性（36）。在其一級結構中，p62含有ETGE樣基序STGE，在被mTORC1磷酸化后產生識別位點與KEAP1對接（37）。然后，KEAP1被轉運到自噬體降解，從而使NRF2積累（38）。此外，一些自噬基因似乎在其啟動子區域含有序列，有報道稱NRF2同時激活伴侶介導的自噬（39）和巨自噬（40，41）。NRF2在氧化條件下在蛋白質穩態中的其他作用通過未折疊蛋白質反應的激活（42,43）及其調節蛋白酶體亞基表達的能力來證明（44,45）。
至少在腦和血液中，編碼NRF2的mRNA豐度高于KEAP1的mRNA（圖2）；相反，KEAP1蛋白的半衰期比NRF2的半衰期長（表2）。這些觀察結果強調了兩種蛋白質的不同轉換率——KEAP1緩慢，NRF2快。此外，盡管NRF2和KEAP1普遍表達，但特定細胞類型主要負責穩態適應并呈現不同的表達水平（圖2）。因此，單核細胞和嗜中性粒細胞在血細胞中表現出最高水平的NRF2，表明先天免疫系統的免疫調節作用（見下文）。在大腦中，星形膠質細胞和神經元之間的相互作用將中間代謝與氧化還原穩態結合起來，至少部分通過NRF2實現（46）。此外，神經元中的谷氨酸能神經傳遞導致產生由神經元GSH池控制的ROS。當該池濃度較低時，鄰近的星形膠質細胞通過向神經元提供GSH前體甘氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺和半胱氨酸來促進其恢復（47）。毫不奇怪，星形膠質細胞中NRF2水平很高（圖2）。此外，與神經元相比，小膠質細胞作為單核細胞譜系的一部分表達高水平的NRF2。
控制炎癥
NRF2在單核細胞和粒細胞中含量豐富(圖2)，提示NRF2參與了這些細胞類型驅動的免疫應答。敲除NRF2的小鼠對敗血癥休克高度敏感（48），并且在創傷愈合過程中表現為持續性炎癥（49, 50）。而NRF2的基因或藥理激活抑制了促炎細胞因子的產生（51 - 56）。在人類細胞中，KEAP1的破壞通過減弱髓系白細胞（57）和巨噬細胞（58）的炎癥反應來預防敗血癥。特別有趣的是，NFE2L2中的一個多態性與轉錄活性降低相關，與炎癥性腸病(IBD)（59）和慢性胃炎（60）風險增加相關。如下所示，NRF2的強抗炎活性至少可歸因于三個獨立的機制：氧化還原代謝的調節；與核因子-κB(NF-κB)的相互作用；對促炎基因的直接調控。
炎癥與局部和全身病理水平的ROS積累增加有關，這可能損害氧化還原信號（61）。線粒體功能障礙和NADPH氧化酶不受控制的激活是炎癥細胞中ROS生成升高的主要因素，線粒體ROS引起mtDNA損傷和釋放，從而形成惡性循環，進一步ROS的產生和炎性小體的激活，最終導致器官功能衰竭（62）。NRF2的氧化還原調節活性是阻止炎癥惡化和隨后組織損傷的惡性循環中的重要突破（63）。
NF-κB和NRF2相互作用。幾個NF-κB功能結合位點已確定在NFE2L2基因啟動子區（64）。另一方面，NRF2抑制NF-κB轉錄活性。用脂多糖（LPS）或TNF處理NRF2缺陷小鼠增加了NF-κB轉錄的表達，表明NRF2對NF-κB的抑制作用（48）。該發現的可能解釋是NF-κB抑制劑（IκB）在NRF2缺陷細胞中高度磷酸化并且經歷快速蛋白酶體降解，從而減少對NF-κB的抑制（48）。此外，LPS顯示同時激活NF-κB介導的快速反應和NRF2介導的緩慢反應，最初的促炎反應由NF-κB驅動，然后當NRF2活性最大時隨后被抑制（65）。NRF2-KEAP1信號通路抑制NF-κB信號傳導的其他機制包括NRF2和p65之間與p300競爭性結合（66）和KEAP1對IκB激酶-β（IKKβ）的降解（67, 68）。
幾種巨噬細胞特異性基因含有ARE序列，因此受NRF2調節。這些包括MARCO（細菌吞噬作用所需的受體）和CD36（氧化低密度脂蛋白的清道夫受體）（69, 70）。 另一方面，NRF2以不依賴ARE的方式結合編碼IL-6和IL-1β促炎基因調節區，并阻止RNA聚合酶II開始轉錄募集（52）。
最近的研究表明巨噬細胞代謝與NRF2引起的抗炎反應有關。線粒體代謝物亞甲基丁二酸是由三羧酸循環在促炎刺激下產生的，在巨噬細胞活化過程中會顯著增加（71, 72）。反過來，亞甲基丁二酸烷基化幾個KEAP1半胱氨酸傳感器，包括關鍵C151、C273和C288殘基，從而激活NRF2并抑制促炎細胞因子如IL-6和IL-1β的轉錄（71）。因此，亞甲基丁二酸是KEAP1的內源性調節劑，在炎癥的控制過程中起到“關閉開關”的作用。此外，通過細胞可滲透的亞甲基丁二酸衍生物4-octylitaconate或SFN激活NRF2，通過降低mRNA穩定性來抑制干擾素基因(STING)的銜接子分子刺激物的表達，從而抑制I型干擾素(IFN)的產生（73，74）。
NRF2-KEAP1信號通路和非腫瘤性疾病
在細胞和動物模型中已經發現了大量關于NRF2對多種慢性疾病保護作用的信息，許多研究使用了NRF2敲除小鼠（75）。關于人類，最近的一項研究為使用系統醫學方法分析NRF2對抗慢性病奠定了基礎，并且基于NRF2與其他分子（NRF2相互作用組）的連通性以及經驗證據，建立了第一個NRF2相關疾?。∟RF2病變）的圖譜（9）。NFE2L2的功能性遺傳變異與疾病風險之間的關聯研究不斷提供有關NRF2在確定人類對慢性病易感性中作用的令人信服的證據。此外，這些遺傳學研究支持這樣一種假設，即對于NFE2L2的某些功能變化，模仿NRF2表達的微小變化的藥物可能具有治療價值。下面，我們將簡要描述NRF2參與人類慢性疾病的一些里程碑性的成果，并重點介紹現有的遺傳學證據。
自身免疫性疾病
氧化組織損傷和細胞凋亡導致半抗原或受損大分子的形成，增加了自身免疫反應的風險。由于NRF2調節的酶在許多化學物質的解毒中起著關鍵作用，因此它提供了一種保護機制，防止對自身免疫發病機制的環境易感性（79）。此外，NRF2抑制促炎T輔助細胞1（TH1）和TH17細胞反應并激活免疫抑制調節性T細胞（Treg）和TH2細胞（80）。NRF2在自身免疫中的相關性已經在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中進行了廣泛研究，其是MS的小鼠模型，MS是一種慢性炎性疾病，其特征在于自身反應性免疫細胞浸潤到中樞神經系統中。在EAE小鼠模型中，NRF2的缺乏加劇了疾?。?1），而KEAP1的敲低（52）或用一系列NRF2激活劑（包括氰基三萜類化合物和SFN）（82,83）治療減弱了其嚴重性。在人類中，通過IFNβ治療患者基因表達譜確定NRF2是長期抗氧化反應和神經元保護的潛在介質（84）。如下所述，一些生物制藥公司正在利用強有力的證據表明NRF2的活化在MS中具有治療價值。事實上，迄今為止唯一獲得美國食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）DMF批準的NRF2激活劑正在由Biogen銷售，用于治療緩解復發型MS和銀屑?。?5）。NRF2的保護作用已被建議用于其他自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡（86, 87）、干燥綜合征（86）、類風濕性關節炎（88, 89）、白癜風（90-92）和STING依賴性干擾素?。?4）。
呼吸系統疾病
肺通過釋放促炎細胞因子和趨化因子對包括煙霧在內的各種環境毒物作出反應。這一主要效應通過循環單核細胞、中性粒細胞和T細胞的募集產生漸進的低度炎癥反應，這些細胞釋放額外的炎癥介質、ROS和金屬蛋白酶。最終結果是肺實質受損的惡性循環，導致慢性阻塞性肺?。–OPD）或肺氣腫（93）。NRF2減輕由ROS和炎癥引起的肺實質負擔。香煙煙霧是COPD和肺氣腫發展的主要危險因素。
NFE2L2-/-小鼠對香煙煙霧引起的肺氣腫的發展比野生型更敏感（94）。此外，長期暴露于香煙煙霧后肺氣腫的發展與細胞保護基因的表達下降有關（95），而五環氰基酮CDDO-咪唑啉保護NFE2L2+/+小鼠對抗香煙煙霧誘導的氧化應激、肺泡細胞凋亡、肺泡破壞和肺動脈高壓，而不是NFE2L2-/-小鼠（96）。NRF2的遺傳上調（通過Clara細胞中的Keap1缺失，其在鼠上呼吸道中是豐富的）具有類似的保護作用（97）。
在人類中，與沒有肺氣腫的患者相比，吸煙相關肺氣腫患者的肺泡巨噬細胞中NRF2轉錄信號降低（98）。人類NFE2L2基因啟動子包含一個含有三個單核苷酸多態性(SNP)序列的單倍型和一個調控NRF2表達的三重重復多態性。具有低至中等啟動子活性的COPD患者更容易發生呼吸衰竭（99）。SFN對NRF2的藥理學激活，或一種干擾KEAP1與NRF2相互作用的化合物，逆轉培養肺泡巨噬細胞和從COPD患者中分離的單核細胞來源巨噬細胞受損的細菌吞噬作用（70,100）。然而，每日口服一定劑量SFN(西蘭花芽苗提取物)的慢性阻塞性肺病患者并沒有導致NRF2依賴性基因表達或肺泡巨噬細胞和支氣管上皮細胞炎癥標志物的一致性變化（101），說明將細胞培養研究結果轉化為人類結果的一些挑戰。其他慢性肺病，如特發性肺纖維化、慢性結節病和過敏性肺炎，被發現在支氣管肺泡灌洗液中表現出NRF2表達增加和內源性抗氧化劑水平增加，表明對病理性ROS水平的適應性反應不成功（102）。
胃腸疾病
胃腸道經常受到外來生物的挑戰，這可能導致形成病理水平的ROS，并可能引發IBD（103）。胃腸道也是膳食及其合成類似物在藥理學上激活NRF2的重要部位之一（23, 104-106）。在小鼠中，右旋糖酐硫酸鈉(DSS)誘導的實驗性結腸炎在NRF2缺陷小鼠中引起的IBD要比野生型小鼠嚴重（107）。在人類中，NRF2在腸細胞對炎癥應激適應的相關性在IBD患者的一項全面轉錄組研究中得到證實，證明了NRF2在減弱腸道巨噬細胞應激反應中的作用（108）。重要的是，在一組日本患者中發現了NFE2L2基因中特定SNP與潰瘍性結腸炎發病風險之間的遺傳關聯（109）。NFE2L2啟動子中3個SNP功能單倍體NRF2表達略有降低，與胃黏膜炎癥和幽門螺桿菌感染相關消化性潰瘍的發生發展有關（60）。
肝臟是抵御食物、外來生物制劑和口服活性藥物的第一道防線，因為從消化道流出的大部分血液通過肝門靜脈直接流到肝臟。早期使用NFE2L2-/-小鼠證實了NRF2對對乙酰氨基酚的保肝作用（110），NRF2的遺傳活化也是如此（111）。正如可能預期的那樣，喂食酒精（4-7天）的NFE2L2-/-小鼠比同樣喂養的野生型小鼠明顯更容易脂肪肝加重、肝臟炎癥反應和肝功能衰竭，這在一定程度上可能是SREBP脂源性轉錄因子的激活和對乙醛解毒的相對無能（112）。通過觀察NRF2在小鼠肝部分切除后對肝臟再生的阻礙，發現NRF2調控NOTCH1基因表達（113），這一機制也參與了NRF2介導的造血干細胞祖細胞功能改善和電離輻射后骨髓抑制（114）。在遺傳性血色素沉著癥伴鐵超載的小鼠模型中(由于穩態鐵調節基因突變)，敲除NRF2增加了小鼠肝臟內導致肝纖維化的壞死炎癥病變（115）。與這些觀察結果一致，原發性膽管炎和肝硬化患者NRF2表達減少（116。）
代謝性疾病
代謝性疾病又稱代謝綜合征，以腹部肥胖、高血壓、高甘油三酯血癥、低水平高密度脂蛋白和空腹高血糖為特征。它與2型糖尿?。═2DM）和相關的合并癥如血管功能障礙、心血管疾病、腎小球腎炎、非酒精性脂肪性肝炎（NASH;見下文）和認知障礙密切相關。盡管T2DM及其合并癥的特征在于線粒體產生過量超氧化物（117），但NRF2缺失小鼠不會自發地發展成糖尿病。實際上，敲除小鼠表現出增加的胰島素敏感性，這歸因于ROS介導的蛋白酪氨酸激酶磷酸酶1B的抑制，該蛋白拮抗胰島素信號（118）。相比之下，db/db背景下小鼠中KEAP1敲除或敲低對NRF2的遺傳激活，或db/db小鼠中NRF2的藥理活化，抑制了T2DM的發生（119）。因此，似乎當胰腺β細胞代謝挑戰合成胰島素以應對高血糖時，所產生的ROS負擔可能會導致氧化損傷、損害反應、導致T2DM（120,121）。如果這個結論是正確的，那么很可能在飲食誘導的T2DM小鼠中，TBE-31或SFN激活NRF2后，胰腺功能的改善對葡萄糖處理的改善有顯著的作用（122,123）以及富含SFN西蘭花芽提取物對T2DM失調肥胖患者空腹血糖和糖化血紅蛋白(HbA1c)的降低作用（123）。除了增加對胰腺β細胞的抗氧化應激能力之外，NRF2活化可通過增加糖原分支酶和磷酸化酶b激酶α的表達來抑制骨骼肌中的糖原分解，從而有助于改善全身葡萄糖穩態（119）。在糖尿病腎病小鼠模型中，SFN或肉桂醛對NRF2的藥理激活已被證明可抑制氧化應激以及轉化生長因子β1信號傳導和纖維化（124）。
NRF2可能在胰島素抵抗中發揮關鍵作用，因為它在糖尿病患者的單核細胞中表達很低（125）。令人信服的證據來自遺傳關聯研究，表明導致低NRF2表達的一些NFE2L2多態性導致病理性ROS和T2DM的風險增加（126-128）。關于并發癥，由于KEAP1啟動子中CpG島的去甲基化導致的抗氧化保護失效與糖尿病白內障有關（129）。
NRF2也可能對NASH的發展具有保護作用。在使用缺乏蛋氨酸和膽堿飲食的NASH小鼠模型中，NRF2缺失小鼠比野生型小鼠死于該疾病的速度要快得多（130,131）。在更為生理的NASH模型中，喂食高脂肪飲食的NRF2缺失小鼠也會出現肝臟脂肪變性和炎癥惡化，這表明需要NRF2來抑制這些癥狀的發生（118, 132）。此外，野生型而非NRF2敲除小鼠，在長期高脂肪、高果糖飲食使其變得肥胖和胰島素抵抗后，通過三環氰基酮TBE-31對NRF2藥理激活后，逆轉了胰島素抵抗，抑制肝臟脂肪變性，改善NASH和肝纖維化（122）。TBE-31對NRF2的藥理激活拮抗SREBP1c和ChREBP及其脂質生物合成靶基因的表達，這可能涉及AMPK的激活（122, 133）。此外，在小鼠肝臟中，NRF2的基因激活可拮抗糖異生酶PEPCK和G6PC的表達，這可能也涉及AMPK（133）。在NASH患者的肝臟活檢標本中，發現病理性ROS水平升高、NRF2基因表達增加，提示其試圖減輕氧化和炎癥（134）。
心血管疾病
ROS的產生和處理之間的不平衡導致破壞性氧化物質的過度形成，已被認為在許多心血管疾病中發揮作用，如高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病血管疾病、心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭（135）。此外，血管壁內的低度持續性炎癥是動脈粥樣硬化易損斑塊的形成過程和發展特點，所以動脈粥樣硬化斑塊易破裂，進而導致血栓形成和終末器官缺血。鑒于NRF2是抗氧化防御的關鍵調控因子，且具有直接的抗炎特性，因此可以合理地假設NRF2可以預防與ROS相關的心血管疾病。事實上，包括富馬酸鹽和硫化氫在內的NRF2激活劑在許多心血管疾病動物模型中顯示出了保護作用，如心臟缺血再灌注損傷（136, 137）和心力衰竭（138, 139）。NRF2在高膽固醇血癥小鼠模型動脈粥樣硬化中的作用就不那么直接了：在骨髓來源細胞中NRF2的缺失加重了動脈粥樣硬化（140, 141），而根據病變發展程度評估的NRF2全面缺失減輕了動脈粥樣硬化（142-145），但增加了斑塊炎癥和易損性（145）。然而，一些NRF2激活劑已被證明在多種動脈粥樣硬化動物模型中具有動脈粥樣硬化保護作用（146-148）。由收縮性、細胞骨架蛋白和分子伴侶蛋白突變引起的心臟疾病約占遺傳性心肌疾病的30%（149）。在某些情況下，還原而不是氧化應激，再加上蛋白質聚集，與心肌病有關。血液透析患者全身炎癥和病理ROS的形成與NRF2的下調有關（150），位于NFE2L2啟動子的多態性與這些患者死亡率的增加有關（151）。NRF2信號通路的破壞可防止還原性應激并延緩過量表達心臟中CRYAB（α-結晶B鏈）小鼠蛋白質性心臟?。?52）。因此，正如這篇綜述所強調的，針對NRF2的環境非常重要——越多不一定越好。
神經退行性疾病
在各種形式的神經退行性疾病中，NRF2和蛋白穩定之間的聯系尤其密切，因為這些疾病的特點是蛋白異常聚集（43）。NRF2在蛋白質病中具有保護作用的令人信服的證據已經在阿爾茨海默?。ˋD）模型的淀粉樣病變（153,154）、tau病變（155）或兩者皆有（40, 156, 157）以及帕金森?。≒D）模型的α-突觸核蛋白病變（158-160）中得到證實。在人類，APP受損和tau損傷神經元NRF2及其靶蛋白p62 / SQSTM1表達增加（40,161）。這些發現與最近報道的NRF2上調巨自噬（40）和分子伴侶介導自噬（39）的基因表達作用是一致的，這是清除APP、tau和α-突觸核蛋白的兩種必要機制。NRF2上調保護神經元免受突變型α-突觸核蛋白和leucinerich重復激酶2（LRRK2）的毒性（162），LRRK2也導致與錯誤折疊蛋白質聚集相關的神經變性（163）。奇怪的是，盡管NRF2激活增加了α-突觸核蛋白的降解，但錯誤折疊的彌漫性LRRK2被隔離到包涵體中。
NRF2在星形膠質細胞和小膠質細胞中的作用尤其重要，因為它們在大腦中表達水平最高(圖2b)。通過使用帶有ARE驅動的堿性磷酸酶報告基因的轉基因小鼠，我們發現星形膠質細胞在幾種神經變性模型中對NRF2的激活反應高度敏感（164），這表明NRF2通過對即將死亡的神經元提供代謝和GSH前體而在星形膠質細胞的培育作用中具有相關性（46, 165）。小膠質細胞作為大腦的免疫應答細胞，在NRF2介導的應答中也起著至關重要的作用（166, 167）。在帕金森毒素甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶致小鼠PD模型中，NRF2可調節小膠質細胞動力學，從而降低COX2、NOS2、IL-6和TNF的生成，并增加多種抗炎標志物的水平（55, 168）。tau損傷神經元激活小膠質細胞似乎至少部分地通過與分形趨化因子相互作用有關。在小鼠和人類，tau損傷神經元釋放出分形趨化因子，抑制鄰近的小膠質細胞中GSK3并導致NRF2蛋白的增加。反過來，NRF2減少TNF和IL-6的釋放，并參與小膠質細胞的重編程，以達到愈合傷口（161）。
一些NRF2靶基因，包括HMOX1、NQO1、GCLM和SQSTM1，在AD和PD腦中上調（159,169-171）。通過對NFE2L2啟動子中3個SNP的功能單倍型與疾病風險之間關系的遺傳分析，證明了這種上調的相關性。在肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)中，一種保護性的單倍體等位基因與疾病發作延遲4年有關（172），但另一項研究沒有發現明顯的關聯（173）。在AD中，另一個單倍型變異與早2年發病有關（76）。已經報道了PD的更詳細證據。最初，保護性單倍型與瑞典隊列中疾病發作延遲相關，并且波蘭隊列PD患者的風險降低（77）。之后，這些研究結果在四個獨立的歐洲病例對照研究中得到了重復（174），但臺灣人口卻沒有（175），這表明存在種族和/或環境差異。NRF2的藥理激活也有望用于治療亨廷頓病(Huntington disease, HD)和弗里德雷希共濟失調(Friedreich ataxia, FRDA)，對于這兩種疾病來說，氧化應激和炎癥是重要的病理驅動因素。在小鼠、來自HD和FRDA患者的模型生物體和培養細胞中進行的研究報告了NRF2信號通路受損（53,176 - 178）以及藥理學NRF2激活劑的有益作用。因此，三唑衍生物對NRF2的激活抑制了HD原代小鼠小膠質細胞和星形膠質細胞以及來自HD患者的培養單核細胞促炎細胞因子的釋放（53），并且在離體HD大鼠皮質紋狀體腦切片和HD果蠅模型中具有神經保護作用（179）。在HD、DMF和三萜類化合物的小鼠模型中，CDDO-乙基酰胺和CDDO-三氟乙基酰胺改善了動物的腦病理和行為（180,181）。用SFN和環狀氰基酮TBE-31或RTA-408處理改善了FRDA小鼠模型成纖維細胞、小腦顆粒神經元以及FRDA患者成纖維細胞的線粒體功能和抗氧化能力（182,183）?？偠灾?，現有證據表明NRF2的適度激活對大腦具有神經保護作用。
NRF2-KEAP1信號通路和癌癥
據報道，NRF2具有抗腫瘤和促腫瘤作用。在這里，我們簡要總結了目前對NRF2在癌癥中作用的理解，并參考了最近在癌癥背景下討論NRF2的全面綜述（12）。
在非惡性細胞中，NRF2激活對氧化劑誘導的遺傳損傷以及化學和物理致癌物具有抵抗性，這是由于NRF2激活增強了機體的防御能力，包括抗氧化（184）、放射性保護（114）以及加速DNA損傷劑的生物轉化和清除（185）。此外，NRF2轉錄反應的激活似乎將ROS水平維持在低于對腫瘤發生關鍵蛋白質發送信號所必需的水平，例如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）、絲裂原活化激酶、缺氧誘導因子1和NF-κB（186）。
相反，在腫瘤發展的早期階段，選擇具有NRF2組成型激活的癌細胞作為能夠適應惡劣微環境、化療、放療或高內源ROS水平的方式。此外，在快速增殖的細胞中，NRF2通過增強核苷酸（26）和氨基酸（187）的生物合成來支持中間代謝，但也會產生代謝失衡和對谷氨酰胺酶的依賴，這可能用于治療（188,189）。
KEAP1的體細胞功能缺失突變或NFE2L2的功能獲得突變在非小細胞肺癌和其他一些環境因素是重要病因的癌癥中很常見（190）。癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中的NRF2突變綜合目錄在10364例中識別出226個獨特的NRF2突變腫瘤，其中33種腫瘤類型中有21種發生了功能獲得性NRF2突變（191）。這種突變的頻繁發生表明NRF2抑制劑在癌癥治療中的潛在益處，從而引發對此類藥物的研究(Box 1)。這些NRF2抑制劑代表了藥理學的一個完全開放的領域，目前處于概念驗證研究的水平。NRF2抑制的替代方法包括靶向依賴NRF2和/或在KEAP1突變癌細胞中選擇性表達的蛋白。例如谷氨酰胺酶（188, 189）和NR0B1的抑制劑，NR0B1是一種非典型的孤兒核受體，在多聚體蛋白復合物中調節KEAP1突變細胞的轉錄（192）。然而，值得注意的是，目前尚無證據表明單單KEAP1或NFE2L2突變能夠引發惡性轉化，與致癌驅動因子共發生似乎是必要的，PI3K通路改變與惡性轉化的相關性最強（193）。
最能說明問題的是，KEAP1亞等位基因敲低的NRF2全基因組上調小鼠不會自發形成腫瘤（194, 195），而小鼠肺中同時缺失Keap1和PTEN則會促進腺癌的形成（195）。重要的是，由此產生的腫瘤具有免疫抑制微環境的特征，可通過免疫檢查點抑制劑進行治療（195）。很明顯，NRF2基因激活是腫瘤發生的重要因素，因為癌基因(KRASG12D)激活嚙齒動物NRF2信號可以增加腫瘤發展（196）,而KEAP1基因敲低(也導致NRF2信號激活)強烈阻礙NOTCH1驅動的腫瘤發生（197）以及紫外線輻射介導的皮膚癌發生（51, 198）。值得注意的是，在后一種模型中，同時喪失NRF2可以消除KEAP1敲低對皮膚癌發生的保護作用（199）。 NRF2的這種兩面作用得到廣泛的實驗證據支持，在這些實驗證據中，NRF2的激活增強了抗腫瘤免疫，以防止肺癌的發生，但只有在腫瘤發生后才會加速惡性生長（200）。此外，與野生型同窩小鼠相比，接受化學誘導致癌作用的NFE2L2敲除小鼠表現出腫瘤數量增加（啟動增強）但體積小得多（進展受損）（201）。因此，低NRF2活性促進癌發生的起始，而持久的組成型高NRF2活性可以驅動癌癥進展和對治療的抗性（202）。
NRF2調節劑的臨床開發
富馬酸酯。富馬酸酯代表一組NRF2激活劑，工業上對此進行了大量的研究。臨床最成功的例子是DMF（化合物1，圖3a），它于1994年被批準用于治療銀屑病，并且基于其在MS的EAE小鼠模型中的功效（203），于2014年被Biogen（Tecfidera）重新用于治療復發-緩解型MS。在發現NRF2之前，對嚙齒動物的早期研究報道DMF是NRF2轉錄靶點GST和NQO1的強效誘導劑（204），后來發現DMF代謝物富馬酸單甲酯(MMF;化合物2，圖3a)與KEAP1中的C151反應，激活NRF2（203）。自從發現DMF的誘導劑活性以來，安全性一直是一個優先考慮的問題，并注意到獲得顯著酶誘導劑所需DMF濃度對嚙齒動物具有良好的耐受性（204）。DMF在兩個III期試驗中表現出良好的安全性和耐受性（205, 206），自其商業化以來，它已成為近年來最成功的新藥之一。然而，Tecfidera的一個缺點是出現輕度至中度腹痛、潮紅、腹瀉和惡心。盡管可以控制這些不良反應，但是更嚴重的癥狀是在治療開始時白細胞計數低的患者發生白細胞減少癥。事實上，用DMF治療的動物神經系統中粒細胞的水平遠低于未接受該藥物治療的動物（207）。該作用與NRF2無關，但很可能是由于羥基羧酸受體的活化，因為缺乏該蛋白質的小鼠具有高水平的粒細胞，無論它們是否用DMF處理（207）。這些觀察結果強調了仔細選擇治療納入標準的重要性。
如上所述，DMF在體內代謝為MMF，通過在C151處形成加合物使KEAP1失活（203）。由于這種代謝轉化，一些生物制藥公司正在開發具有緩慢和持續釋放MMF的化合物，與DMF相比，其顯示出改善的生物利用度和更少的副作用（表1）。Alkermes（被Biogen收購）開發了富馬酸迪羅西酯（BIIB098，以前為ALK8700，化合物3;圖3a），一種具有降低GI副作用的MMF前藥，現在正在進行MS的III期臨床試驗（NCT03093324）。 XenoPort（由Arbor Pharmaceuticals收購）開發了富馬酸富馬酰胺，一種MMF前藥（XP23829，化合物4，圖3a）。與DMF相比，XP23829在臨床前模型中具有更高的溶解度和滲透性，口服給藥后更大的吸收，改善功效和降低GI副作用，并且現在處于斑塊狀銀屑病的II期臨床試驗中（NCT02173301）。Catabasis制藥公司正在開發另一種MMF和二十二碳六烯酸(CAT4001)的化學連接偶聯物，與單獨的生物活性分子相比，這種偶聯物具有增強細胞靶向性、有效性、安全性和耐受性的潛力。特定的酶釋放細胞內的兩個組件，同時調整多個生物目標，包括細胞和動物模型中的NRF2和NF-κB, 并顯示出治療神經退行性疾?。ㄈ鏔RDA和ALS）的前景。V ClinBio正在開發一種類似的技術，用于治療MS和銀屑病的MMF和二十碳五烯酸（VCB101，化合物5，圖3a和VCB102）的結合物（表1）。
蘿卜硫素（SFN）。SFN一種廣泛應用的天然親電NRF2激活劑 (化合物6，圖3a)。該化合物最初由Paul Talalay和Yuesheng Zhang作為十字花科植物提取物NRF2靶酶NQO1的主要誘導物分離得到的（208），并與KEAP1的C151相互作用(14，209)。值得注意的是，SFN可通過血腦屏障（55），并在許多神經系統疾病的臨床前模型中具有保護作用（210）。在一項針對患有自閉癥譜系障礙年輕男性的雙盲安慰劑對照臨床試驗中，口服富含SFN的西蘭花芽提取物膠囊，通過異常行為檢查表和社會反應量表評估，在行為方面改善顯著；這些量表上的總分數在停止治療后逆轉至治療前水平（211）。三日齡的西蘭花芽富含葡萄糖苷，一種SFN前體分子，可被植物黑芥子酶水解，釋放出SFN和葡萄糖（212）。類似的β-硫葡糖苷酶存在于腸道微生物群中；因此，釋放的SFN實際水平高度依賴于飲食習慣和微生物組成，受抗生素治療的影響（213）并表現出晝夜節律（214）。并且，無論是芽苗提取物還是高度純化的SFN，已有超過500名受試者接受超過25,000劑量，證明了具有高度安全性。目前有超過20個正在進行的臨床試驗。
考慮到天然化合物知識產權的相關問題、SFN在室溫下不穩定以及需要精確控制劑量，Evgen Pharma開發了SFN的藥物形式，SFX-01（化合物7，圖3a） 。 SFX-01是化學合成的SFN，包裹在環糊精中，形成穩定的固體形式的丸劑或膠囊，具有良好的生物利用度。SFX-01目前正在用于蛛網膜下腔出血(NCT02614742)和轉移性乳腺癌(NCT02970682)臨床試驗(表1)。Evgen還有一系列基于SFN的新型類似物，這些類似物正處于臨床前評估階段。此外，許多營養保健品公司正在生產含有NRF2誘導劑的制劑，包括SFN，具有不同程度的標準化。其中一個例子是來自Nutrinov實驗室的Prostaphane，它是一種穩定的游離SFN，從花椰菜種子中提取，在前列腺癌的安慰劑對照臨床試驗中顯示了在根治性前列腺切除術后控制生化復發的優勢（215）。SFX-01和Prostaphane的生物利用度和效力等同于穩定性較差的SFN（216）。另一個例子是膠囊膳食補充劑Avmacol（Nutramax Laboratories），含有來自精細研磨的花椰菜種子的蘿卜硫苷和冷凍干燥的西蘭花芽粉末以提供黑芥子酶。該補充劑目前正在臨床試驗中用于調節與自閉癥譜系障礙、精神分裂癥和環境污染有關的疾病癥狀和/或生物標志物（217）。
氰基酮三萜。越來越多的證據表明，富馬酸酯、SFN以及與KEAP1共價結合的其他小親電試劑可以從更大的支架結構中受益，以賦予更好的選擇性（和可能的效力）和更可控的藥代動力學和/或藥效學特性。含五環邁克爾受體的氰基酮三萜類化合物的開發可滿足這些要求。這些五環三萜類化合物最初由Michael Sporn、Gordon Gribble和Tadashi Honda開發，來自天然產物齊墩果酸（218, 219），這些五環三萜類化合物是迄今已知最有效的親電子NRF2激活劑（220），由KEAP1中的C151檢測，目前正在由Reata Pharmaceuticals和Kyowa Hakko Kirin進行臨床開發。
兩種臨床上先進的化合物，bardoxolone methyl（BARD;化合物8，圖3a）和omaveloxolone（化合物9），能使代謝正?；?、增加線粒體能量產生、增強細胞抗氧化能力和降低ROS水平（221）（表1）。在臨床前研究中，BARD或類似物已被證明可通過減少炎癥、纖維化和氧化應激以及增加腎小球的過濾表面積來改善腎功能（222, 223）。通過修改選擇標準以排除有早期心力衰竭跡象的患者（B型利鈉肽升高），BARD目前正在臨床試驗中測試幾種與慢性腎?。–KD）相關的罕見病癥，大多數沒有經批準的治療方法，包括Alport綜合征（NCT03019185）、常染色體顯性遺傳性多囊腎病、免疫球蛋白A（IgA）腎病、1型糖尿病和局灶性節段性腎小球硬化（NCT03366337），其中促炎和促纖維化過程造成腎小球硬化和腎功能受損（224）。BARD治療有可能延緩或預防腎小球濾過率下降，而腎小球濾過率下降會導致Alport綜合征和其他罕見形式CKD患者需要透析或移植。因此，在患有T2DM和CKD患者的II期臨床試驗中（NCT02316821），BARD治療可使直接測量腎小球濾過率的統計學顯著增加，并且在排除具有液體潴留風險患者后，耐受性良好。在這些結果的基礎上，Kyowa Hakko Kirin在患有G3期或G4期CKD的糖尿病患者中，在日本SAKIGAKE指定系統的支持下，開展了III期臨床試驗（NCT03550443）。
此外，BARD正在用于研究肺動脈高壓（PAH）（NCT03068130）和結締組織?。–TD-PAH）引起的PAH（NCT02657356），這是一種導致心力衰竭和死亡的嚴重和進行性疾病。CTD-PAH與特發性病因之間的差異很大程度上歸因于炎癥、自身免疫和系統性血管病變之間復雜的相互作用，這些相互作用促成了結締組織疾病的發病機制。由于NF-κB的上調，CTD-PAH患者的炎癥加重（225），對現有血管擴張劑治療的反應性低于特發性PAH患者，預后較差（226）。在II期研究中，對CTD-PAH患者進行了BARD測試，目前正在III期研究中進行測試。Omaveloxolone目前正在FRDA患者（NCT02255435）的II期臨床試驗中進行測試，這是一種遺傳性神經肌肉疾病，其NRF2被下調（176-178）。值得注意的是，目前尚無批準治療FRDA的療法（227）（表1）。
硝基脂肪酸。脂肪酸的硝化衍生物(NO2-FAs)是內源性信號介質，在代謝和炎癥疾病的臨床前動物模型中具有抗炎和抗纖維化活性（228）。硝基烯烴基團賦予其β-碳親電性，促進與親核試劑如半胱氨酸的可逆NO2-FA邁克爾加合物的快速形成，這種改性稱為硝基烷基化（22, 230）。已經表明，硝基油酸（NO2-OA; 9-硝基十八碳-9-烯酸）與KEAP1中的半胱氨酸反應，包括C273和C288，從而激活NRF2（231,232）。該反應的可逆性阻止了穩定的NO2-FA硫醇加合物積累的可能性，這可能導致細胞毒性（219,230,233）。實際上，I期安全性評估證明了先導化合物CXA10（10-NO2-OA; 10-硝基-十八碳-9-烯酸，NO2-OA的特異性區域異構體）（化合物10，圖3a）在藥理活性劑量下對人體是安全的（234）。目前，Complexa正在開發CXA10作為局灶性節段性腎小球硬化和PAH的治療方法（234）（表1）。最近報道了來自α-生育酚的硝基烯烴合成和生物學評價（235）。
羥胺。一個特殊的挑戰是提供可以通過血腦屏障的NRF2激活劑。給藥途徑（注射、口服或局部）對特定疾病也至關重要。Othera Pharmaceuticals（現由Colby Pharmaceutical收購）正在開發一種具有抗氧化特性的二取代羥胺（OT551），局部應用，通過靶向KEAP1抑制氧化應激和疾病相關炎癥（化合物11，圖3a）。在臨床前研究中，該化合物的眼用溶液保護視網膜色素上皮細胞和光感受器免受氧化損傷和炎癥反應，并且一項關于年齡相關性黃斑變性的II期試驗已證明可有效預防視力喪失的進展（NCT00485394）（表1）。
TFM735。一種高通量篩選報告子策略評估了包含融合到LacZ (NRF2d-LacZ)236的NRF2氨基末端區域嵌合蛋白的穩定性，該策略確定TFM735為先導化合物（化合物12，圖3a）。TFM735以C151依賴性方式激活NRF2，并抑制受刺激的人外周血單核細胞中IL-6和IL-17合成以及小鼠EAE進展（237）。該化合物目前由Mochida Pharmaceuticals進行治療MS的臨床前開發（表1）。
NRF2-KEAP1蛋白-蛋白相互作用抑制劑。近年來，非親電性非共價化合物的發展受到關注，這些化合物可以直接干擾KEAP1和NRF2之間的PPI(238)，或者干擾KEAP1和CUL3之間的PPI(239)。通過直接干擾KEAP1和NRF2或CUL3之間的相互作用，化合物的作用方式不需要共價結合組分。該方法具有潛在的優點，包括探索NRF2誘導物的新化學型的范圍，由于與KEAP1的不同相互作用模式導致的不同藥效學以及由于半胱氨酸非依賴性結合機制導致的不同脫靶效應譜。有證據表明，親電子和非親電子（PPI）KEAP1抑制劑的生物學效應譜不同，一個例子是非親電試劑誘導線粒體自噬的能力，與SFN和DMF等親電試劑相比；這表明兩種化合物類別之間藥理活性和治療效用的潛在差異。
PPI抑制劑的設計是以KEAP1的Kelch結構域的晶體結構可用性為指導的(241-243)(圖3b)。已經報道了幾種類型的PPI抑制劑；根據制藥行業投入開發的主要化學類別如圖3b所示。萘雙磺酰胺化合物起源于Biogen的高通量篩選（244），隨后由中國藥科大學Jiang等人提供化合物13（CPUY192018）和類似物（245）。該雙羧酸化合物是KEAP1的高親和力配體，在低微摩爾濃度下誘導ARE依賴性基因的表達。Astex和葛蘭素史克還從基于X射線晶體學碎片的篩選程序中鑒定了含磺酰胺的鉛化合物。在這種情況下先導化合物的例子是化合物14，KEAP1-NRF2 PPI低納摩爾抑制劑，它能增加COPD患者上皮細胞中NRF2靶基因NQO1的表達。該化合物能夠在靜脈內給藥后減輕大鼠的肺部炎癥，并有效抑制臭氧誘導的支氣管肺泡液中白細胞的積累并恢復GSH濃度（246）。來自該系列的化合物已經在幾種模擬肺病特征的氧化應激動物模型中顯示出功效，并且目前正在開發用于臨床評估。已經開發了另外兩類不是磺酰胺的單酸性PPI抑制劑。第一類是由胡等人在Rutgers開發（247），由Evotec和UCB Pharma詳細描述（248），包括四氫異喹啉(例如化合物15)，它們是KEAP1-NRF2 PPI的低微摩爾抑制劑。第二類是由Toray Industries和RIKEN開發的，并加入了惡二唑基序；化合物16是PPI抑制劑，具有微摩爾范圍內的結合活性（249）。突出顯示的化合物或其類似物已與KEAP1 Kelch域共結晶；圖3b顯示了化合物13-16所獲得的結合位點亞袋的占用情況，并為這些配體未來的精煉提供了思路。
C4X Discovery利用計算化學、配體核磁共振光譜和蛋白質結晶學方法以及Keapstone利用基于結構的藥物設計方法聯合開發了新的PPI抑制劑。學術團體也在為非親電NRF2誘導物研究做出貢獻（250,251）。
如何使PPI抑制劑具有適當的藥物代謝和藥代動力學特性，用于外周神經系統和中樞神經系統，仍然是一個重大挑戰，后者是一個需要具有強安全性NRF2激活劑用于長期給藥等條件的領域，如AD和PD。此時，非親電性PPI抑制劑改善靶向選擇性的潛在優勢被當前化合物相對較高的分子質量、阻斷較大KEAP1-NRF2界面的要求以及極性官能團賦予KEAP1緊密結合親和力的需要所抵消。因此，目前通過體外研究鑒定的許多原型化合物表現出較差的吸收、分布、代謝和排泄性質。例如，萘雙磺酰胺（化合物13）對DSS誘導的小鼠結腸炎具有保護作用，在低微摩爾范圍內激活NCM460培養細胞中NQO1表達，并在體外與納米級Kd結合，說明蛋白質結合與生物活性之間的相互抵消（252）。
大多數PPI抑制劑的體內評價都集中在外周炎癥。例如，化合物NK-252（化合物16的類似物）被Toray Industries鑒定為相當弱的KEAP1抑制劑，但對H2O2誘導的細胞毒性具有保護作用并且降低了膽堿缺乏的l-氨基甲酸鹽飲食大鼠（NASH模型系統）的纖維化評分（253）。
用KEAP1非依賴性藥物靶向NRF2。越來越多的證據表明，NRF2除了KEAP1所發揮的作用外還表現出多層調節，如轉錄（196）、表觀遺傳（254,255）、共價蛋白修飾（258,257），以KEAP1非依賴性方式進行蛋白酶體降解（258-261）以及NRF2二聚體伴侶的靶向結合ARE序列的調節（262,263）。在藥理學發展水平上，ARE介導的基因調控的KEAP1非依賴性機制涉及調節轉錄抑制因子BACH1（廣泛復合物，tramtrack、bricàbrac和cap'n'collar同源體1），該機制抑制NRF2調控基因亞基的失活，尤其是HMOX1（28）。vTv 療法現在正在分析該亞基是否足以引起治療用處。他們開發了一類新的非親電子小分子，可以獨立于KEAP1抑制BACH1與某些ARE驅動基因的結合（264）。
挑戰與思考
藥效學評價。考慮到NRF2的半衰期很短，即使在藥物誘導穩定后，也需要通過間接指標來推斷其在病變器官中的激活情況，從而確定最合適的治療方案。一種可能性是分析可接觸的細胞或組織（如外周血單核細胞、鼻腔灌洗液細胞、脫落的膀胱細胞、頰細胞和皮膚）中的藥物分布和NRF2基因表達特征，希望NRF2的轉錄組特征反映了其他組織（如肺，肝和腦）的局部參與（265-267）。群體不可避免地暴露于有害環境化學物質的情況下，尿液中相應代謝物的水平已被用作NRF2介導的藥效學作用生物標志物（268,269）。
NRF2通路的激活表現為依賴于時間、組織、劑量、發病時間和持續時間的差異基因表達。表2顯示了NRF2調控基因產物代表性亞群的半衰期。由于其中許多蛋白質的半衰期相當長，其生物化學活性的持續時間預計將遠遠長于NRF2穩定的時間間隔或其藥理激活劑的存在，后者通常在數小時內被清除。因此，NRF2活化分子的藥效學觀察時間比NRF2水平要長得多，且與血漿藥物濃度不一致。因此，NRF2激活劑TBE-31（一種與上述三萜類化合物密切相關的三環氰基酮）在小鼠皮膚和血漿中的半衰期為10小時（51,270），而NRF2依賴的NQO 1誘導蛋白在最后一劑局部應用藥物3天后仍可在皮膚中檢測到（51）。因為NRF2激活劑導致“刺激產生或抑制控制測量效果的因素”，所以“間接藥效學反應”模型可能是用于測試NRF2激活劑藥效學走向臨床應用的更合理方法（272,272）。
NRF2活化藥物在相關組織中的濃度和分布，以及它們的溶解度、細胞通透性、代謝穩定性和蛋白結合，也將在NRF2活化程度中發揮重要作用，最終達到預期的長效藥效學效果。因此，優化臨床有意義的藥物暴露需要通過一個假定的NRF2激活劑分析劑量依賴性基因調控。此外，NRF2靶向參與研究必須考慮患者的年齡和表現狀態，因為在年齡較大和健康狀況較差的受試者中，藥物激活NRF2或促進“適應性反應”的能力似乎有所下降。最近在DMF復發緩解型和多發性硬化癥患者的臨床試驗中發現，NRF2轉錄靶NQO1的誘導程度與患者年齡呈負相關, 在4 - 6周高NQO1蛋白含量的患者在開始治療后的第二年更有可能沒有疾病活動的證據（267）。
藥物選擇性。KEAP1中高活性半胱氨酸的鑒定對于理解親電化合物與泛素連接酶底物適配器共價作用的機制至關重要。結構信息表明，某些作用于C151的藥物可能會干擾與CUL3-RBX1的相互作用(273, 274)，從而使KEAP1庫被結合的NRF2飽和，并允許新合成的NRF2逃避降解: 這是用親電試劑n -碘乙酰- n -生物素己二胺模型證明的（275）。其他化合物可能會修飾KEAP1，使其不再能夠在轉錄因子內的高親和力和低親和力位點與NRF2相互作用。值得注意的是，一些親電的NRF2激活劑，如環氰烯酮，以共價形式與硫醇結合，但不形成不可逆的加合物（276,277）。因此，它們結合了不可逆共價藥物(即高效力和持續的靶點參與)和可逆非共價藥物(即缺乏永久性修飾，因此可能破壞或免疫原性其蛋白靶點)的理想特性（278）。這類分子的一個潛在缺點是，它們可能與KEAP1以外的蛋白質中對氧化還原敏感的半胱氨酸發生反應，從而影響其功能。巰基反應性分子的特異性問題表明，對于每種化合物，需要確定在其他蛋白質中不存在硫醇修飾的情況下允許治療相關KEAP1修飾的窗口（圖1b）。KEAP1內的靶半胱氨酸以及其他含巰基的非靶蛋白的這種分層呈現被稱為“半胱氨酸代碼”（279），并且受誘導劑的化學和劑量影響（280）。
KEAP1-NRF2 PPI抑制劑的一個重要潛在優勢是提高了靶點的選擇性。然而，對于任何小分子，不能完全排除脫靶效應。此外，KEAP1靶向NRF2以外的蛋白進行泛素化，這些蛋白也可能受到影響（281）。PPI抑制劑的脫靶選擇性已被評估的幾種類型之一是強效單酸性磺胺類；例如，化合物14似乎對KEAP1具有相當的選擇性，在葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline)增強的體外實驗交叉屏幕面板中顯示出適度的活性，以識別潛在的脫靶效應（246）。
動物模型。阻礙大多數慢性病藥物開發成功的一個問題是動物模型中人類病理的不完全可復制性（288）。這一問題可能與人類退行性疾病缺乏一個非常重要的標志有關，即與NRF2相關的體內平衡功能的逐漸喪失。事實上，盡管在人類仍有許多工作需要做，但動物研究證據表明，NRF2活性隨著年齡的增長而下降，并且NRF2的藥理學或遺傳學上調可延長壽命并改善健康狀況（283, 284）。慢性疾病動物模型缺乏“NRF2變量”，這在AD小鼠模型中得到了很好的證明。目前的模型是基于這樣的假設，即有毒的APP或tau突變蛋白在原本健康的動物背景下的表達復制了人類的病理。盡管這些模型提供了關于蛋白病的發病和進展的有價值信息，但是它們未能將治療成功應用于人類。這種失敗的原因可能與這些模型不考慮與NRF2相關穩態功能的疾病相關性下降這一事實有關。更復雜的臨床前模型將需要一種反向翻譯方法，這種方法不僅要在動物身上復制特定疾病的解剖病理特征，而且要復制受損的氧化還原、炎癥或蛋白穩態。因此，NRF2敲除小鼠與AD患者甚至老年人有許多共同改變（156）。最近的研究表明，與野生型動物相比，喂食高脂肪食物的NRF2敲除小鼠表現出更大的神經血管功能障礙、血腦屏障破壞、神經炎癥、淀粉樣基因表達和認知能力下降，這與隨著年齡增長而發生的許多表型變化類似（285）。引入低NRF2表達作為降低穩態反應的變量，可能有助于改進現有的慢性病模型，以獲得更好的治療效果?？紤]到隨著衰老NRF2活性的緩慢下降，雜合的NFE2L2 +/-小鼠可能是復制基礎表達減少和藥理學上調的合適模型。
癌癥風險。從藥理學角度來看，有必要確定NRF2水平升高超過致癌安全閾值的風險有多大(圖4)。促進NRF2在癌細胞中穩定性的體細胞突變影響與NRF2的藥理學激活引起的影響存在顯著差異。因此，KEAP1和NFE2L2的體細胞突變導致NRF2活性升高而不受限制，這與NRF2激活劑的藥理作用引起的脈沖激活完全不同。動力學特征，如曲線下的振幅和面積，反映NRF2信號的強度和持續時間，在基因激活設置和藥理學手段方面有很大差異（202, 286）。此外，KEAP1基因丟失或失活突變似乎與該蛋白的藥理學抑制作用不一樣。因此，KEAP1丟失導致的NRF2活性以及E3連接酶適配器的幾個致癌靶標（包括IKKβ和B細胞淋巴瘤2，bcl-2）增加，可能至少是惡性轉化的部分原因。因此，在具有功能性KEAP1的一組細胞系中，成熟的NRF2激活劑，即BARD類似物RTA-405，增加NRF2但不增加IKKβ或BCL-2水平，并且不賦予腫瘤細胞生長或存活優勢（287）。
雖然目前NRF2激活劑的癌癥風險不能被忽視，但令人鼓舞的是，DMF III期試驗薈萃分析顯示安慰劑和DMF治療組之間的癌癥發生率沒有差異（288）。 同樣重要的是要注意，一些NRF2激活藥物如果具有抗腫瘤作用的其他靶標可以降低這種風險。因此，最近發現DMF抑制GAPDH（289），并且這種抑制可能導致高度糖酵解的KRAS或BRAF突變癌細胞的能量危象，從而阻止腫瘤發展，如維生素C（290）。
展望
許多慢性疾病的標志是喪失穩態，如氧化還原信號、代謝靈活性、炎癥控制和蛋白質穩態。這些復雜疾病的多因素性質可以通過對轉錄因子NRF2的單次靶向激活，產生有益的、全面的、多靶點和持久的細胞保護作用。盡管KEAP1-NRF2系統的特殊性使得這種方法在監測靶向參與和脫靶效應方面特別具有挑戰性，但生物制藥公司正在緩慢而穩定地開發針對NRF2主要調控因子KEAP1的藥物。此外，需要明確排除增加癌癥風險的擔憂。在未來幾年，正在進行的臨床試驗無疑將在回答這些問題方面取得重要進展。
圖1：KEAP1對NRF2的調控及其藥理靶標。
圖2：KEAP1和NFE2L2 mRNA在人腦和血液中的表達。
圖3：KEAP1結構域的晶體結構。
圖4：根據NRF2的狀態調節癌癥風險。
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